背景

免疫荧光是一种技术，通过结合与荧光染料（如异硫氰酸荧光素（FITC））化学共轭的特定抗体，可以在细胞或组织切片中显示特定蛋白质或抗原。有两种主要的免疫荧光染色方法：1）直接免疫荧光染色，其中用荧光染料标记一级抗体；2）间接免疫荧光染色，其中用荧光色素标记的二级抗体识别一级抗体。免疫荧光染色可以在固定在载玻片和组织切片上的细胞上进行。免疫荧光染色样品在荧光显微镜或共焦显微镜下检查。

由于荧光染料（如荧光素和罗丹明）可以与抗体偶联而不破坏其特异性，因此结合物可以与抗原复合并通过荧光显微镜观察。该显微镜通过一个或多个波长的光激发所选染料，该波长又发射由选择性滤光片捕获的特征波长的光。然后用局部荧光区域投影图像，指示由不同颜色的抗体标记的不同抗原。

常见荧光标签：激发和发射

直接免疫荧光

抗体本身与荧光色素结合，并直接应用于单层细胞或载玻片上的冷冻组织。当用荧光显微镜检查时，用荧光化合物标记的抗体识别局部抗原。

间接免疫荧光

与直接免疫荧光不同，间接免疫荧光是一种双层技术。将未标记的抗体直接施加到组织基质上，然后用荧光色素结合的抗IgG处理。这种方法有几个优点，通常比直接方法使用得更频繁。由于几种荧光抗免疫球蛋白可以与第一层中的每种抗体结合，因此产生比直接法更亮的荧光。由于只有一种荧光标记试剂，即在漫长的接合过程中制备的抗IgG，因此它也更省时。本文提出了一种仅用于间接免疫荧光技术的通用方案。

免疫荧光协议-组织

所需材料

• 组织切片

• 盖玻片

• 滑动机架和托盘

• 用盖子给盘子染色

• 轨道振动筛

• PAP笔和移液管

• 去离子水（ddH2O）

• PBS（磷酸盐缓冲盐水）

• 一级抗体

• 荧光标记二抗

• 正常血清

• 甘油

样品制备

1.将样品灌流或解剖并固定在4%多聚甲醛固定剂中。

2.将组织转移到PBS中的20%蔗糖中，在4°C下过夜。

3.将组织转移到PBS中的30%蔗糖中，在4°C下充分浸渍。当组织下沉时，它完全受孕。

4.冻结并切割5-20mm厚的晶体切片

阻塞步骤

5.将载玻片在PBS中5%正常血清（二抗宿主血清）中孵育1小时。

6.用PBS清洗，3x 5分钟。

一级抗体培养

7、在黑暗中RT条件下，在PBS、0.1%正常血清中与荧光共轭二抗孵育1-2小时。（从这一点开始，将幻灯片置于黑暗中。）

8、用PBS清洗3次。为了减少背景，可在PBS中加入0.1%吐温20。

荧光检测

9.安装盖玻片。

10立即使用荧光显微镜进行检查，或将其平放在4°C的暗处。

免疫荧光协议-细胞

注：细胞应直接在多孔板、小室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

所需材料

• 美国公共广播电视公司

• 多聚甲醛

• 甲醇

• 蒸馏水（dh2O）

• PBST:1X PBS，0.1%Triton X-100。为制备1L，向900ml dH2O中添加100ml 10X PBS。添加1ml Triton X-100并混合。

• 一级抗体

• 荧光色素结合二抗

• 安装介质

试样制备

1.为了增加细胞粘附性，在室温下用1:10稀释的聚赖氨酸溶液处理盖玻片5分钟。

2.以适当稀释的平板细胞生长，直到细胞达到所需的汇合度（~ 70%）

3.抽吸介质

4.在PBS中短暂冲洗细胞。

固定步骤

5.抽吸PBS，用PBS中2-4%的甲醛覆盖电池（在通风柜中工作）。让细胞在室温下固定15分钟。

6.吸取固定液，在PBS中冲洗3次，每次5分钟。

渗透（可选）

甲醇和丙酮的固定导致通透性细胞制剂。对于多聚甲醛固定制剂，用0.2%Triton X-100处理5分钟，或者用-20°C甲醇处理5分钟。

7.甲醇渗透步骤：甲醛固定后，用冰凉的100%甲醇覆盖细胞（使用足够的甲醇将细胞完全覆盖到3-5mm的深度，不要让细胞干燥），将细胞在甲醇中在冰箱中培养10分钟。

8.在PBS中漂洗5分钟。

阻塞步骤

注：除非另有说明，否则所有孵化均应在室温下进行，放置在潮湿的不透光盒或有盖的培养皿中，以防止干燥并防止荧光色素暴露在光下。

9.在PBS、1%Triton X-100中，将样本阻断在与二级抗体（如正常山羊血清、正常驴血清）相同物种的5%正常血清中1小时。（推荐的封闭缓冲液可以在1-2%牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白或2%TBS（PBS）中的非脂奶粉（含或不含0.2%吐温20和0.02%叠氮化钠）之间变化。）

一级抗体培养

10.在PBS中稀释一级抗体，0.1%Triton。典型体积为：每节50-100ul，每盖玻片、腔室或井（48或96孔板）25-50ul。

11.吸取封闭液，涂抹稀释的一抗。

12.在4°C下轻轻搅拌或摇动过夜。

13.在PBS、0.1%Triton X-100中冲洗3次，每次5分钟。

二级抗体培养

14.用在PBS中稀释的荧光铬结合二级抗体，0.1%Triton X-100在黑暗中RT培养1-2小时。（从这一点开始，幻灯片需要保持在黑暗中。）

15.在PBS、0.1%Triton X-100中冲洗。

荧光检测

16.安装盖玻片。

17.立即使用荧光显微镜进行检查，或将其平放在4°C的黑暗中。