这是一种非常敏感的方法。用以构成HRPO-抗过化物酶（PAP）复合物的抗体，其类型必须与被桥连抗体所识别的第一抗体相同。

操作方法

基本方案

材料与仪器

组织样品
PBS 过氧化氢 PAP 二氨基联苯胺
离心机 加湿盒 培养箱

步骤

1.  将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒，由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入玻片盒中（每边放6片），或故湿盒中（载玻片勿相互接触）。   2.  待载玻片达室湿且未干时，铺加PBS于切片上（勿溢出玻片）。   3.  室温下在含0.25%过氧化氢的PBS中温育30 min，以PBS洗3次。

4.  稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每一载玻片上加40~50 μl 抗体，应能盖住切片）。   5.  用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1 h。
6.  以PBS冼玻片3次（5 min/次），从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。   7.  载玻片上加特异性桥连二抗，室温温育1 h。以PBS洗3遍。

8.  加PAP复合物，室温放1 h。以PBS洗3遍。   9.  室温下DAB底物液显色2~5 min。（显色时间长短依实验经验而定）。

10.  冼片并固片，置玻片盒中在暗处存放（不必冻存）。

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