原理与背景

IPPD（N-异丙基-N′-苯基对苯二胺）是轮胎橡胶中广泛使用的防老剂，用于防止臭氧引起的橡胶龟裂。IPPD在轮胎生产过程中以及轮胎磨损颗粒（TWP）沉积于环境后，经氧化转化生成IPPD醌（即IPPD系列的6PPD醌类似物）。该醌类转化产物引起了学界和监管机构的高度重视，因为结构相关的醌类转化产物（如6PPD醌）已被证实对银大马哈鱼（Oncorhynchus kisutch）及其他水生物种具有急性毒性。

IPPD-quinone-d5是对应的氘代内标。五个氘原子取代N-苯基环上的五个芳香氢原子，使分子量比未标记分析物增加+5 Da。由于其化学性质与IPPD醌几乎完全相同，在反相液相色谱中与天然化合物共洗脱或洗脱时间差异极小，而质谱仪可将二者区分，因此非常适合用于稳定同位素稀释分析（SIDA）。

材料与仪器

• IPPD-quinone-d5（货号Q1539362，Aladdin Scientific）
• HPLC级乙腈或DMSO（无水，≥99.9%）
• 棕色玻璃容量瓶及小瓶（1–4 mL），配PTFE衬垫瓶盖
• 分析天平（可读性≤0.01 mg）
• 氮气或氩气吹扫管路
• 配备反相C18色谱柱（如100 mm × 2.1 mm，1.7 µm粒径）及电喷雾离子化（ESI）源的LC-MS/MS系统
• 微量移液器（2–200 µL量程），配低吸附吸头
• 通风橱及适当个人防护装备（丁腈手套、实验服、安全护目镜）

操作步骤

步骤1 — 储备液配制

1. 在通风橱内将IPPD-quinone-d5小瓶恢复至室温后再开启，以避免水分在固体上冷凝。
2. 在去皮分析天平上称量所需量的IPPD-quinone-d5，记录精确质量。
3. 定量转移至棕色容量瓶中，用HPLC级乙腈或DMSO溶解，配制储备液（典型浓度：1 mg mL⁻¹或1 mM；请根据实验需求确认适当浓度）。
4. 轻柔涡旋30 s；如需完全溶解，可在冰浴中超声不超过2 min。
5. 封口前用氮气或氩气吹扫烧瓶顶空。标注化合物名称、批号、浓度、日期及操作人。
6. 储备液于-20 °C避光保存。

步骤2 — 工作液配制

1. 将储备液用HPLC级乙腈/水（或流动相）稀释至所需工作浓度（典型环境基质通常为10–100 ng mL⁻¹）。
2. 每次分析当天新鲜配制工作液；若已验证稳定性，可于4 °C保存不超过7天。

步骤3 — 样品加标

1. 在提取或稀释前，向每份样品、空白及校准标准品中加入固定已知体积的内标工作液，确保最终内标浓度在检测线性范围内。
2. 充分混匀，平衡至少5 min后再进行样品前处理。

步骤4 — LC-MS/MS分析

1. 使用反相C18色谱柱，以含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈进行梯度洗脱。
2. 在正离子ESI模式（或根据化合物离子化优化选择负离子模式）下操作质谱。对IPPD醌和IPPD-quinone-d5各选择两个MRM跃迁（一个定量离子对，一个定性离子对）。
3. 确认d5标记内标峰与天然分析物峰均与基质干扰峰色谱分离良好。
4. 利用天然分析物峰面积与内标峰面积之比，结合以相同内标浓度构建的校准曲线，计算分析物浓度。

质量控制与故障排除

每批次分析至少包含一个方法空白、一个加标空白及一个有证参考物质（如有）。内标回收率目标：70–120%；全批次内标精密度（CV）：≤15%。

安全、储存与废弃物处置

安全：IPPD-quinone-d5属于醌类化合物。醌类物质可刺激皮肤和眼睛，反复接触可能引起致敏。始终在通风橱中操作，佩戴丁腈手套、实验服及安全护目镜。使用前请查阅安全数据表（SDS）。避免吸入粉尘或气溶胶。

储存：纯品及储备液均应于-20 °C在惰性气氛下储存于棕色玻璃小瓶中。尽量减少冻融循环；条件允许时分装为单次使用份。乙腈溶液的稳定性通常优于水性基质溶液。

废弃物处置：所有废液及受污染材料须按照当地机构及政府关于危险化学废弃物的法规进行处置。禁止倒入下水道，因为醌类转化产物已被证实对水生生物具有毒性。