L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐：稳定同位素标记试剂
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐：稳定同位素标记试剂
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ dihydrochloride is a fully heavy-isotope-labeled form of the essential amino acid lysine，在其分子骨架中引入六个碳-13原子和两个氮-15原子，专为基于SILAC的蛋白质组学及高分辨质谱工作流程而设计的定量内标试剂。
- CAS号 / 产品货号
- L1444084（Aladdin货号）；交叉参考 MCE-TJY：HY-W009762S
- 同位素标记
- 碳骨架上含6个¹³C；α-氨基和ε-氨基上含2个¹⁵N
- 名义质量偏移
- 比未标记L-赖氨酸约重8 Da，可在质谱谱图中与轻型对应物清晰区分
- 盐型
- 二盐酸盐（2 HCl），提高水溶性和储存稳定性
- 主要应用
- SILAC（细胞培养中氨基酸稳定同位素标记法）定量蛋白质组学
- 推荐储存条件
- 建议于−20°C避光防潮保存；条件允许时在惰性气氛下操作
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐简介
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐是蛋白质源性氨基酸L-赖氨酸的合成同位素富集衍生物。赖氨酸骨架上的全部六个碳原子均被碳-13（13C）取代，α-氨基和ε-氨基上的两个氮原子均被氮-15（15N）取代。该化合物以二盐酸盐形式供应，以提高水溶性并在标准实验室储存条件下保持化学稳定性。
由于赖氨酸是哺乳动物无法自身合成的必需氨基酸，外源提供的重型赖氨酸可在细胞培养过程中高效掺入新合成的蛋白质，而不会经代谢途径转化为其他氨基酸——这是相较于同位素标记实验中其他某些标记残基的重要优势。
该化合物由Aladdin Scientific收录，货号为L1444084，交叉参考MCE-TJY目录编号HY-W009762S。
同位素特性与质谱意义
同时引入13C和15N同位素，相对于未标记L-赖氨酸的单同位素质量，产生约+8 Da的质量偏移。该偏移量足够大，几乎可在所有现代高分辨质谱仪（包括Orbitrap、Q-TOF和三重四极杆仪器）上清晰分辨重型和轻型肽段对，且不与轻型对应物的天然同位素包络发生光谱重叠。
双标记策略（¹³C₆,¹⁵N₂）相较于单标记变体具有更优越的准确性。碳-13和氮-15标记的共同存在，最大限度降低了重型和轻型通道之间同位素交叉污染的风险，提高了定量测量的信噪比，从而能够精确定量不同实验条件下蛋白质表达变化的相对丰度。
高同位素纯度至关重要：重型试剂中残留的未标记氨基酸会在定量比值中引入系统性低估误差。研究人员应核验每批次随附的同位素富集证书（通常每种同位素≥98原子%）。
SILAC实验方案与细胞培养整合
细胞培养中氨基酸稳定同位素标记法（SILAC）是L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐的主要应用场景。在典型的双重SILAC实验中，一组细胞在含普通（¹²C,¹⁴N）赖氨酸的标准培养基中培养，另一组细胞在含重型标记赖氨酸（¹³C₆,¹⁵N₂）的培养基中培养。经过至少五至六次细胞倍增——足以实现接近完全（>97%）的同位素掺入——两组细胞按总蛋白质量1:1混合，共同用胰蛋白酶酶解（胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基后切割），随后进行LC-MS/MS分析。
关键实验方案注意事项包括：
- 透析血清：标准FBS中含有游离氨基酸，会稀释重型标记的摄取效率；应使用透析FBS（分子量截留值≤10 kDa）以去除内源性赖氨酸。
- 精氨酸共标记：为实现全蛋白质组覆盖，通常将重型L-精氨酸（如13C₆或13C₆,¹⁵N₄）与重型赖氨酸联合使用，以标记所有胰蛋白酶肽段。
- 掺入率验证：建议在大规模实验前，通过预实验测量参考蛋白或总蛋白质组酶解物的重/轻比值，以验证掺入率。
- 浓度匹配：培养基中重型赖氨酸的浓度应与轻型对应物一致，以避免对细胞生长或代谢产生差异影响。
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐也可用作绝对定量工作流程的内标加标试剂，以及靶向蛋白质组学检测方法（如SRM/MRM、PRM）的验证标准品。
操作、储存与质量注意事项
储存：将该化合物于−20°C密封避光防潮保存。二盐酸盐形式具有吸湿性；暴露于环境湿度中会导致称量误差，进而在配制储备液时引起浓度偏差。建议干燥保存，每次使用后迅速重新密封。
储备液配制：溶于超纯水或0.1 M盐酸，配制高浓度储备液（如50–100 mM）。加入细胞培养基前过滤除菌（0.22 µm滤膜）。避免反复冻融；建议分装为单次用量的小份储备液。
需核验的质量参数：
- 同位素富集度：13C ≥98原子%，15N ≥98原子%（通过分析证书确认）
- 化学纯度：≥98%（HPLC）
- 结构确认：通过NMR或高分辨质谱确认
安全性：该化合物在正常实验室操作条件下急性毒性较低。请遵循标准实验室安全规程：佩戴适当个人防护装备（手套、实验室工作服、护目镜），避免吸入粉尘，并按照当地法规处置废弃物。详细危害信息请参阅安全数据表（SDS）。
常见问题
L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐在LC-MS/MS实验中产生多大的质量偏移？
六个¹³C原子和两个¹⁵N原子共同赋予该化合物相对于未标记L-赖氨酸约+8 Da的质量偏移。该偏移量足够大，可在高分辨质谱仪上完全分辨含重型和轻型赖氨酸的肽段，且不受天然同位素分布的光谱干扰。
重型赖氨酸完全掺入SILAC所需的细胞倍增次数是多少？
通常情况下，在含重型赖氨酸的培养基中经过五至六次细胞倍增，大多数哺乳动物细胞系的同位素掺入率即可超过97%。研究人员在进行定量蛋白质组学实验前，应针对每种细胞系（尤其是生长缓慢的细胞或原代细胞）实验验证掺入率。
为何在含重型赖氨酸的SILAC培养基中必须使用透析血清？
标准胎牛血清（FBS）含有较高浓度的游离氨基酸，包括未标记的赖氨酸。若使用未透析的血清，内源性轻型赖氨酸会在摄取过程中与重型标记形式竞争，降低同位素掺入效率，影响定量测量的准确性。透析FBS（分子量截留值≤10 kDa）可去除游离氨基酸，同时保留支持细胞生长的大分子物质。
该化合物能否用于蛋白质绝对定量？
可以。除用于经典SILAC相对定量外，L-Lysine-¹³C₆,¹⁵N₂ 二盐酸盐还可作为绝对定量策略（如AQUA法）的加标内标，或用于校准靶向蛋白质组学检测方法（SRM/MRM、PRM）。将已知量的重型标记合成肽段加入样品，与内源性肽段信号进行比较，即可测定蛋白质的绝对丰度。
购买该试剂时，应要求的同位素纯度标准是什么？
对于定量蛋白质组学应用，通常建议¹³C和¹⁵N的同位素富集度均≥98原子%。较低的同位素纯度会引入系统性误差：重型试剂中残留的未标记氨基酸会导致重/轻比值被低估。使用前请务必索取批次特定的分析证书，并确认同位素富集度和总体化学纯度（HPLC法≥98%）均符合要求。
参考文献
- Ong, S.-E. et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics, 2002.
- Mann, M. Functional and quantitative proteomics using SILAC. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006.
- Bantscheff, M. et al. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007.
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