LDH活性检测方案：DNPH微量法试剂盒
LDH活性检测方案：DNPH微量法试剂盒
Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity Assay Kit (DNPH, Micro Method) is 一款灵敏的比色微量检测试剂盒，通过基于DNPH的显色原理检测乳酸氧化生成的丙酮酸，从而定量测定细胞裂解液、组织匀浆、血清及其他生物样品中乳酸脱氢酶的酶活性。
- 检测方法
- 比色法（基于DNPH的丙酮酸检测，于440 nm处读取吸光度）
- 样品类型
- 细胞裂解液、组织匀浆、血清、血浆及其他生物液体
- 检测格式
- 微量法，适用于少量样品
- 检测原理
- LDH催化乳酸氧化生成丙酮酸，丙酮酸与DNPH反应形成有色腙类化合物，通过分光光度法定量检测
- 产品货号
- L1524120
- 酶单位定义
- LDH活性一个单位通常定义为在规定检测条件下每分钟催化1 µmol底物转化的酶量
检测原理
乳酸脱氢酶（LDH；EC 1.1.1.27）是几乎存在于所有细胞中的胞质酶，催化乳酸与丙酮酸之间的可逆相互转化，同时伴随辅酶NAD+/NADH的氧化还原反应。细胞外培养基或生物液体中LDH活性升高是细胞膜损伤和细胞毒性的广泛应用指标。
本DNPH微量法检测分两步进行：
- 酶促反应：样品中的LDH以NAD+为电子受体，将L-乳酸氧化为丙酮酸，同时生成NADH。
- 比色检测：酶促反应生成的丙酮酸在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应，形成棕色的丙酮酸-2,4-二硝基苯腙复合物。碱化后，该腙类化合物在440 nm处显示最大吸光度的稳定颜色，其光密度与丙酮酸浓度及LDH活性成正比。
微量格式在保持分析灵敏度的同时最大限度地减少样品用量，特别适用于珍贵或低体积样本。
材料与试剂
试剂盒内含（L1524120）：
- 底物缓冲液（含L-乳酸和NAD+）
- DNPH试剂（2,4-二硝基苯肼溶液）
- NaOH溶液（用于显色）
- 丙酮酸标准品溶液（用于标准曲线制备）
- 检测缓冲液
需自备（试剂盒未提供）：
- 微型离心机及离心管
- 微量移液器及枪头（2–200 µL范围）
- 96孔微孔板或比色皿
- 可在440 nm处测量吸光度的分光光度计或微孔板酶标仪
- 设定为37 °C的培养箱或水浴锅
- 冰桶
- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）或适合的裂解缓冲液（用于样品制备）
样品储存：样品制备过程中请置于冰上。避免反复冻融，因其可能降低LDH活性。请尽快处理样品，或储存于−80 °C。
逐步操作流程
1. 样品制备
- 细胞裂解液：用PBS洗涤细胞，用适当的裂解缓冲液裂解，于4 °C以600–1000 × g离心5分钟，收集上清液。
- 组织匀浆：在冷检测缓冲液中匀浆组织（质量体积比约1:9），于4 °C以600–1000 × g离心10分钟，收集上清液。
- 血清/血浆：使用前用检测缓冲液适当稀释。
2. 标准曲线制备
- 将提供的丙酮酸标准品稀释，制备覆盖线性检测范围的一系列标准品。
- 每次实验均包含空白对照（用检测缓冲液代替样品）。
3. 酶促反应
- 将适量样品（或标准品）加入标记的微量离心管中。
- 加入底物缓冲液并轻轻混匀。
- 按照试剂盒说明书规定的时间于37 °C孵育（具体孵育时间请参阅试剂盒文件）。
4. 显色
- 向每管中加入规定量的DNPH试剂并混匀。
- 按照试剂盒说明书规定的时间于37 °C孵育。
- 加入NaOH溶液，充分混匀，按照试剂盒说明书规定的时间在室温下显色。
5. 吸光度测量
- 将反应混合物转移至96孔板或比色皿中。
- 以空白对照为参比，在440 nm处测量吸光度。
6. 计算
- 绘制标准曲线（吸光度与丙酮酸浓度的关系）。
- 根据标准曲线推算样品丙酮酸浓度。
- 使用试剂盒文件提供的公式计算LDH活性，并根据需要对样品蛋白质含量（mg蛋白）或细胞数量进行归一化处理。
故障排除与注意事项
信号低或无信号：
- 确认样品未过度稀释，重新优化稀释倍数。
- 确认底物缓冲液含有活性NAD+，避免重溶后长时间储存。
- 检查酶促步骤全程是否维持37 °C孵育温度。
- 确认在酶促孵育后及时加入DNPH试剂。
本底高 / 标准曲线非线性：
- 使用前确保所有试剂（样品除外）达到室温。
- 检查样品是否被含丙酮酸的培养基或缓冲液污染，此类污染可人为升高读数。
- 使用新鲜配制的DNPH试剂；老化或储存不当的DNPH可能降解。
样品干扰：
- 溶血血液样品含有大量内源性LDH，将导致结果假性升高；采血过程中应避免溶血。
- 样品裂解缓冲液中的强还原剂可能干扰DNPH显色；请提前验证相容性。
一般注意事项：
- 所有样品和标准品应平行或三复孔检测，以提高数据可靠性。
- 将LDH活性归一化至总蛋白质含量或细胞数量，以实现有意义的样品间比较。
- 检测准备过程中所有试剂置于冰上。
数据解读与报告
LDH活性表达：LDH活性通常表示为每毫克总蛋白的单位数（U/mg蛋白）或每百万细胞的单位数（U/106细胞），其中一个单位（U）代表在规定检测条件下每分钟转化1 µmol底物的酶量。具体单位定义请参阅试剂盒说明书。
细胞毒性评估：将LDH作为细胞毒性标志物时，计算相对于最大LDH释放对照（用去垢剂完全裂解细胞）和自发释放对照（未处理细胞）的LDH释放百分比。计算公式为：
% 细胞毒性 = [(实验LDH释放 − 自发释放) / (最大释放 − 自发释放)] × 100
LDH升高的解读：培养上清液或生物液体中LDH活性升高反映膜通透性增加或细胞死亡。在组织样品中，LDH升高可提示缺血、炎症或其他病理状态。
质量控制：可接受的结果要求标准曲线各点复孔间变异系数（CV）低于15%，且标准曲线线性R2 ≥ 0.99。对读数超出线性范围的样品，应适当稀释后重新检测。
常见问题
LDH活性检测试剂盒（DNPH微量法）适用于哪些样品类型？
该试剂盒适用于细胞裂解液、组织匀浆、血清和血浆。应避免使用溶血样品，因为来自裂解红细胞的内源性LDH会导致读数假性升高。检测前请务必离心去除样品中的细胞碎片。
为什么DNPH微量法优于其他LDH检测格式？
基于DNPH的微量法需要极少量样品，非常适合活检来源的组织匀浆或小体积细胞培养等有限或珍贵样品。440 nm处的终点比色读数稳定，兼容标准分光光度计和微孔板酶标仪。与需要连续监测的动力学NAD(H)法相比，DNPH终点法检测具有灵活的吸光度测量时机。
如何对LDH活性数据进行归一化以实现样品间比较？
将LDH活性归一化至总蛋白质浓度（通过BCA或Bradford法测定），结果以U/mg蛋白表示。或者，对于细胞培养实验，可归一化至细胞数量（U/10⁶细胞）。在同一实验中对所有样品进行一致的归一化处理对于有意义的比较至关重要。
该试剂盒是否可用于测量LDH释放作为细胞毒性读值？
是的。释放到培养上清液中的LDH是细胞膜损伤和细胞毒性的经典指标。收集条件培养基，离心去除细胞碎片，直接对上清液进行检测。包含最大裂解对照（用去垢剂处理的细胞）和自发释放对照（未处理细胞）以计算细胞毒性百分比。
DNPH LDH检测中高本底的最常见原因是什么？
高本底最常见的原因包括样品缓冲液或培养基中的丙酮酸污染、DNPH试剂降解，或样品含有强还原剂干扰显色。确保所有缓冲液不含丙酮酸，使用新鲜配制的DNPH试剂，并在正式检测前验证裂解缓冲液的相容性。
参考文献
- Bergmeyer HU, Bernt E. Lactate dehydrogenase. In: Methods of Enzymatic Analysis. 2nd ed. Academic Press; 1974.
- Korzeniewski C, Callewaert DM. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 1983;64(3):313-320.
- Decker T, Lohmann-Matthes ML. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. J Immunol Methods. 1988;115(1):61-69.
产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。
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