背景与原理

脂褐素是一种自发荧光、电子致密的色素，随着细胞衰老在有丝分裂后细胞（尤其是神经元、心肌细胞和肝细胞）中逐渐积累，是氧化蛋白质和脂质溶酶体降解不完全的副产物。其积累被广泛认为是细胞衰老和持续氧化应激的标志性特征。

醛品红（AF）法利用脂褐素相关脂质过氧化产物中存在的醛基反应性。酸化品红染料以其醛反应形式选择性结合这些氧化基团，将脂褐素沉积物染成特征性深紫罗兰色，从而与周围组织成分明显区分。

本试剂盒（货号：L774536）提供醛品红染色全流程所需的预配试剂，支持在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或冰冻组织切片中稳定、便捷地检测脂褐素。

试剂盒组成与储存

脂褐素染色试剂盒（醛品红法，L774536）包含四个组分，储存要求如下：

• L774536A — 室温避光保存。
• L774536B — 室温保存。
• L774536C — 室温保存。
• L774536D — 2–8°C避光保存。

收货后，请确认所有组分完好并按规定条件储存。避免光敏试剂（A和D）长时间暴露于环境光或荧光灯下。除非明确说明，否则请勿冷冻各组分。

染色操作步骤

以下为醛品红染色操作的一般流程概述。各组分具体用量和孵育时间请务必参阅试剂盒随附的详细说明书。

1. 切片制备：将FFPE或冰冻组织切成推荐厚度（FFPE通常为4–8 µm）。将切片贴于正电荷或多聚赖氨酸包被载玻片上，充分晾干。
2. 脱蜡与复水（FFPE切片）：经二甲苯脱蜡，再经梯度乙醇系列复水至蒸馏水。冰冻切片需自然晾干，根据具体方案需要可短暂固定。
3. 氧化步骤：按说明将氧化试剂（参见试剂盒组分说明）作用于切片，在室温下孵育规定时间。此步骤可使脂褐素相关脂质过氧化产物产生醛基。
4. 洗涤：用蒸馏水充分冲洗玻片，去除多余氧化剂。
5. 醛品红染色：按说明配制醛品红工作液（由试剂盒组分配制），作用于切片并孵育推荐时间。脂褐素沉积物将染成深紫罗兰色。
6. 分化：按规定在适当溶剂或酸性乙醇溶液中短暂分化，以去除非特异性背景染色。
7. 复染（可选）：如需要，可用适当试剂（如亮绿或苏木精）复染以增强组织对比度。
8. 脱水与封片：经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用永久封片剂封片。
9. 显微镜观察：在明场显微镜下检查。脂褐素呈深紫罗兰色颗粒状沉积，通常分布于核周。

注意：具体孵育时间、试剂用量及工作液配制说明详见试剂盒L774536随附说明书，请严格按照说明书操作以获得最佳结果。

结果判读与对照设置

预期结果：脂褐素沉积物呈深紫罗兰色颗粒状内含物，特征性地以核周分布模式出现于神经元、肝细胞和心肌细胞等有丝分裂后细胞中。沉积物的数量和强度通常随组织供者年龄增大和氧化损伤程度加重而增加。

阳性对照：使用已知含有丰富脂褐素沉积的老龄动物或人体组织切片（如老龄脑、肝或心脏），以确认试剂工作正常。

阴性对照：省略醛品红染色步骤（仅用溶剂替代），以评估非特异性背景染色和自发荧光的影响。

脂褐素与其他色素的鉴别：脂褐素具有自发荧光（宽谱发射），应与黑色素（Masson-Fontana染色阳性，无自发荧光）和含铁血黄素（普鲁士蓝染色阳性）区分。在特异性要求较高时，建议结合自发荧光显微镜进行验证。

故障排除

以下列出醛品红脂褐素染色中常见问题及处理建议：

• 无染色或染色极浅：确认试剂组分A已避光保存且未降解。验证氧化步骤是否正确执行并达到所需时间。确认工作液按说明现配现用。
• 非特异性背景过高：逐步延长分化步骤并重新评估。确保氧化步骤后玻片已充分洗涤。检查组织固定质量——过度固定的组织可能增加背景。
• 切片上有沉淀：使用前用0.22 µm滤膜过滤醛品红工作液。确保试剂充分溶解并恢复至室温后再使用。
• 批次间结果不一致：同一实验中尽量使用同批次试剂盒组分。工作液应现配现用，并严格遵守各组分储存条件，尤其是组分D（2–8°C，避光）。
• 自发荧光干扰：若使用荧光显微镜进行确认，应加入自发荧光淬灭步骤，或使用适当滤光片组以区分脂褐素发射信号与醛品红染料信号。