一、实验原理

         人外周血PBMC的分离依靠密度梯度离心，不同细胞群密度不同：红细胞和大部分粒细胞沉到底部，血浆位于最上层，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）富集在血浆与分离液交界处形成白色细胞环，即PBMC。通过吸取这一白膜层即可获得相对纯净的PBMC，为后续分选提供起始材料。

CD4⁺T细胞的获取采用磁珠负向分选。生物素化抗体先特异性标记PBMC中的非CD4⁺细胞，再用与生物素结合的磁珠将这些细胞“带磁”。细胞悬液通过置于磁场中的磁柱时，带磁的非CD4⁺细胞被截留在柱内，未被标记的CD4⁺T细胞随洗脱液流出被收集。由于目标细胞本身不直接负载磁珠和抗体，其表面受体和功能状态更接近原始状态，适合作为下游功能实验材料。

二、实验材料

1.样本与基础材料

抗凝人外周血（如肝素或EDTA抗凝，全血体积约3 mL/样本）

15 mL无菌离心管、采血管

兼容磁柱的离心管（如15 mL或5 mL管）

2.试剂

1×PBS缓冲液

淋巴细胞分离液（用于PBMC密度梯度分离）

MACS缓冲液（通常为PBS+0.5%BSA+2 mM EDTA）

CD4⁺T Cell Biotin-Antibody Cocktail, human

CD4⁺T Cell MicroBead Cocktail, human

3.主要仪器

水平离心机

磁力分选架+磁柱

生物安全柜/超净工作台

流式细胞仪

移液器及配套无菌枪头

三、实验步骤

1.人外周血PBMC的分离

（1）血液稀释

取3 mL抗凝外周血，加入等体积3 mL 1×PBS，轻轻吹打混匀，得到6 mL稀释血液悬液。

（2）铺于分离液上层

在15 mL离心管内预先加入3 mL淋巴细胞分离液，随后将3 mL稀释过的抗凝血缓慢沿管壁平铺于分离液上方，避免剧烈冲击导致两层混合。

（3）密度梯度离心

将离心管置于水平离心机中，在室温条件下，600 g离心30 min。离心结束后可观察到清晰的分层：上层血浆，中间一层白色混浊的细胞层（PBMC），下层为分离液和红细胞。

（4）PBMC收集与洗涤

使用移液器小心吸取中间白膜层细胞，转移至新的15 mL离心管中，加入约10 mL 1×PBS混匀，在室温下1000 rpm离心10 min。离心后弃去上清，每管加入2 mL MACS缓冲液重悬细胞，并进行细胞计数，调整细胞数量，每个样本不超过1×10⁷个细胞。

（5）磁珠标记前准备

将重悬后的细胞以2000 rpm离心3 min，弃去上清，保留细胞沉淀，用于后续磁珠分选步骤。

2.CD4⁺T细胞磁珠分选

以下步骤建议全程4℃或置于冰上操作，以尽可能维持细胞活性和表面抗原完整性。

（1）生物素抗体预标记

向每管细胞沉淀中加入40 μL MACS缓冲液重悬细胞，随后加入10 μL CD4⁺T Cell Biotin-Antibody Cocktail, human，轻轻混匀，在4℃孵育5 min。

（2）磁珠标记

孵育结束后，每管再加入30 μL MACS缓冲液混匀，然后加入20 μL CD4⁺T Cell MicroBead Cocktail, human，充分混匀后继续于4℃孵育10 min，使磁珠与已标记的CD4⁺T细胞结合。

（3）磁柱预平衡

将分选柱安装于磁力架上，向柱中加入3 mL MACS缓冲液预润洗柱子，待缓冲液自然流出且不再滴落后，更换下方收集用离心管。

（4）上样与洗柱

将标记好的细胞悬液缓慢加入分选柱中，待细胞悬液完全流出后，再加入3 mL MACS缓冲液洗柱，将洗脱液完全收集于离心管中。完成后先将离心管从磁力架下取走，再将分选柱从磁力架上移除。

（5）细胞收集

将收集到的细胞悬液于1500 rpm条件下离心5 min，弃去上清。

四、常见问答

Q1：分选后CD4⁺T细胞纯度偏低，可能是什么原因？

CD4⁺T细胞纯度偏低，多见于一次上柱细胞太多导致磁柱饱和、抗体或磁珠量不够或孵育时间不足、孵育时未充分混匀出现细胞聚团，以及个别样本本身CD4表达低或细胞状态差。建议控制好每柱细胞总数，按说明书足量加抗体和磁珠并保证孵育时间，孵育过程中轻柔颠倒混匀，必要时可做两轮分选提高纯度。

Q2：分选后细胞总数明显偏少或死亡率较高怎么办？