原理与概述

哺乳动物基因组DNA提取试剂盒（蛋白酶K法）的工作原理分为两个阶段。第一阶段，蛋白酶K——一种广谱丝氨酸蛋白酶——在变性缓冲液条件下消化蛋白质（包括组蛋白及其他DNA结合蛋白），使基因组DNA从核基质中释放出来；同时，含去垢剂的裂解缓冲液破坏细胞膜和核膜，确保核酸充分释放。

第二阶段，将裂解液加入硅胶膜离心柱，基因组DNA在高盐离液条件下选择性结合至膜上，蛋白质、脂质及其他杂质通过连续洗涤步骤去除，最终用低盐洗脱缓冲液或无核酸酶水洗脱高分子量纯化基因组DNA，可直接用于下游分子生物学实验。

材料与试剂

试剂盒组成（具体体积及储存条件请参阅试剂盒说明书）：

• 细胞/组织裂解缓冲液
• 蛋白酶K溶液
• RNase A溶液（可选，用于去除RNA）
• 结合缓冲液（离液型，高盐）
• 洗涤缓冲液I
• 洗涤缓冲液II（含乙醇）
• 洗脱缓冲液或无核酸酶水
• 硅胶膜离心柱及收集管

另需自备材料（试剂盒不含）：

• 转速≥13,000 × g的微量离心机
• 加热块或水浴锅（56 °C及70 °C档位）
• 移液器及无菌无核酸酶吸头
• 1.5 mL及2 mL微量离心管
• 100%乙醇（分子生物学级）
• 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）

注意：具体组分名称和体积可能有所不同，请以货号M1527094随附的最新试剂盒说明书为准。

详细操作步骤

第一步 — 样品制备

培养细胞：以300 × g离心5分钟收集细胞，吸去培养液，用冰冷PBS洗涤沉淀一次。组织样品：取新鲜或冷冻组织（通常≤25 mg），在冰上用无菌刀片充分切碎，转移至1.5 mL离心管中。

第二步 — 裂解与蛋白酶K消化

向样品中加入适量裂解缓冲液和蛋白酶K溶液，充分涡旋或吹打混匀，于56 °C孵育1–3小时（或直至完全裂解），期间间歇混匀。若需去除RNA，可在继续操作前加入RNase A，于室温孵育5分钟。

第三步 — 结合

向裂解液中加入规定体积的结合缓冲液，充分混匀。将混合液转移至置于2 mL收集管中的硅胶膜离心柱，以≥10,000 × g离心1分钟，弃去流穿液。

第四步 — 洗涤

向离心柱中加入洗涤缓冲液I，以≥10,000 × g离心1分钟，弃去流穿液。再用洗涤缓冲液II重复洗涤一次。最后以≥13,000 × g空转离心2分钟，彻底去除残余乙醇（乙醇残留会抑制下游酶促反应）。

第五步 — 洗脱

将离心柱转移至干净的1.5 mL微量离心管中，将预热至70 °C的洗脱缓冲液或无核酸酶水加至膜中央，室温孵育2–5分钟以提高洗脱效率，然后以≥10,000 × g离心1分钟，收集含纯化基因组DNA的洗脱液。如需最大化回收率，可用少量洗脱液进行第二次洗脱。

第六步 — 质量评估

用分光光度法测定DNA浓度及纯度（A260/A280比值在1.7–1.9之间表明纯度较高）。可将少量样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，确认高分子量DNA的完整性。纯化后的DNA可于−20 °C长期保存，或于4 °C短期保存。

常见问题及解决方法