一、目的与适用范围

1.1目的

Masson三色染色用于在石蜡组织切片中区分不同组织成分的分布与比例，典型读出为：

（1）胶原纤维、黏液、软骨等结缔组织成分；

（2）肌纤维、胞浆（细胞质）、红细胞等；

（3）细胞核。

该方法广泛应用于：

①各脏器纤维化程度评估（肝、心、肺、肾等）；

②肌纤维与胶原纤维的定性/半定量分析；

③血栓、纤维蛋白沉积及基底膜等结构的观察。

1.2适用标本

（1）常规10%中性缓冲甲醛固定的组织石蜡切片（3–5μm）。

（2）其他固定液处理的标本可使用本规程，但染色时间与对比度可能需要适当微调。

二、原理与染色机制

2.1染色原理概述

（1）苏木精（Regaud或Weigert型）与细胞核中的核酸结合，使细胞核呈黑蓝色，且对后续酸性染料具有较好耐受性。

（2）丽春红–酸性复红为混合酸性阴离子染料，可优先与胞浆、肌纤维、纤维蛋白等蛋白质中的碱性基团结合，使这些成分呈现红色。

（3）磷钼酸可从胶原纤维上置换掉部分酸性染料，对丽春红、酸性复红具有分化作用，为后续胶原特异性染料提供结合位点。

（4）苯胺蓝或光绿对胶原纤维具有较强亲和力，可在磷钼酸预处理基础上优先结合胶原，使其呈蓝色（苯胺蓝）或绿色（光绿）。

（5）低浓度冰醋酸可提高色调纯度，增强红/蓝（或红/绿）之间的对比度。

2.2染色结果对应关系

（1）胶原纤维、黏液、软骨：蓝色（苯胺蓝）或绿色（光绿）。

（2）肌纤维、胞浆、纤维蛋白、神经胶质：红色。

（3）细胞核：黑蓝色或深蓝色。

三、试剂与材料

3.1标本与切片准备

（1）固定：10%中性缓冲甲醛固定，时间一般24h左右。

（2）包埋：常规石蜡包埋。

（3）切片：3–5μm厚，附着于预涂有粘附剂的载玻片上，60℃烤片30–60min。

3.2主要试剂配方

（1）Regaud氏苏木精

①苏木精1g

②95%乙醇10mL

③甘油10mL

④蒸馏水80mL

配制要点：

①将苏木精加入部分蒸馏水中加温溶解，冷却后加入95%乙醇与甘油；

②补足蒸馏水至体积，混匀；

③室温避光放置数日成熟后使用；

④使用前过滤。

（实验室如常规使用Weigert铁苏木精染核，可按现行配方替代。）

（2）Masson丽春红酸性复红染液

①丽春红0.7g

②酸性复红0.3g

③蒸馏水99mL

④冰醋酸1mL

配制要点：

①将丽春红与酸性复红溶于蒸馏水中，充分溶解；

②加入冰醋酸，混匀；

③室温避光保存，使用前过滤。

（3）冰醋酸水溶液

①0.2%冰醋酸：冰醋酸0.2mL，加蒸馏水至100mL。

（部分实验室也使用2%冰醋酸作短暂浸洗，可根据既定SOP调整但需固定下来。）

（4）1%磷钼酸水溶液

①磷钼酸1g

②蒸馏水加至100mL

使用前充分溶解，定期更换。

（5）苯胺蓝染液

①苯胺蓝2g

②蒸馏水98mL

③冰醋酸2mL

（6）光绿染液（可选，替代苯胺蓝）

①光绿1g

②蒸馏水100mL

3.3其他试剂与材料

（1）二甲苯：脱蜡与透明。

（2）梯度乙醇：100%、95%、80%、70%。

（3）自来水与蒸馏水。

（4）中性树胶封片剂。

（5）常规染色架、染色缸、显微镜等。

四、操作步骤

4.1脱蜡至水

（1）切片60℃烤片30–60min。

（2）二甲苯2次，各10min。

（3）100%乙醇2次，各5min。

（4）95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2–3min。

（5）自来水充分冲洗，再入蒸馏水洗，备用。

4.2核染色

（1）苏木精染核

①将切片置于Regaud或Weigert苏木精染液中5–10min；

②自来水充分冲洗；

③如核染偏深，可用1%盐酸酒精快速分化数秒；

④再用自来水蓝化（若为铁苏木精，蓝化可略或按实验室惯例处理）。

（2）蒸馏水冲洗，去除自来水盐分。

4.3丽春红酸性复红染色（胞浆/肌纤维）

（1）将切片置入Masson丽春红酸性复红染液中5–10min（一般5–8min）。

（2）取出后用蒸馏水快速冲洗数秒，去除浮色，避免红色过深掩盖后续胶原染色。

4.4分化与胶原染色

（1）冰醋酸水洗

①切片置于0.2%冰醋酸水溶液中浸洗约30s–1min；

②轻轻晃动染缸，以获得更清晰、饱和的色调。

（2）磷钼酸分化

①将切片转入1%磷钼酸水溶液中3–5min；

②分化过程中可抽查1–2片在显微镜下观察：当肌纤维和纤维蛋白仍保持红色，而胶原纤维仅呈淡粉红色时为宜。

（3）胶原染色（苯胺蓝或光绿）

①自磷钼酸分化液中取出切片，轻甩余液，不经水洗；

②立即置于苯胺蓝染液或光绿染液中约5min；

③染色期间可轻微晃动以保证均匀上色。

（4）冰醋酸水洗

①将切片置于0.2%冰醋酸水溶液中浸洗约30s–1min；

②轻轻晃动，去除多余游离染料，增强红/蓝（或红/绿）对比。

4.5脱水、透明与封片

（1）95%乙醇1–2次，各1–2min。

（2）100%乙醇1–2次，各1–2min。

（3）二甲苯透明2次，各5min。

（4）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，避免气泡，室温晾干。

五、染色结果与判读

5.1理想染色表现

（1）胶原纤维、黏液、软骨：

①苯胺蓝体系：呈均匀蓝色；

②光绿体系：呈均匀绿色。

（2）肌纤维、胞浆、纤维蛋白、神经胶质：

呈鲜红或砖红色，轮廓清楚。

（3）细胞核：

呈黑蓝或深蓝色，核膜与核染色质结构可辨。

5.2判读要点

（1）胶原与肌纤维色调分离度应高，色彩不应混浊或灰暗。

（2）若用于纤维化分析，可配合图像分析软件（如ImageJ/Fiji）进行胶原体积分数定量；需确保不同批次染色条件一致。

（3）异常结果需结合H&E染色、临床信息和其他专项染色综合解读。

六、质量控制与常见问题处理

6.1质量控制要点

（1）每次染色建议夹带一份已知纤维化阳性对照组织，用于监控染色稳定性。

（2）所有染液使用前过滤，防止沉淀、结晶和杂质引起背景污染或局部上色异常。

（3）磷钼酸溶液与Masson丽春红酸性复红染液需根据使用频率与染色效果定期更新。

6.2常见问题及调整策略

（1）胶原与肌纤维颜色分界不清

①可能原因：磷钼酸分化不足；

②处理建议：适当延长磷钼酸分化时间，并在显微镜下实时观察终点。

（2）肌纤维、胞浆红色过浅

①可能原因：丽春红染色时间过短或磷钼酸分化过度；

②处理建议：延长丽春红染色时间或缩短磷钼酸分化时间。

（3）背景发灰、色调不鲜艳

①可能原因：染液老化、冰醋酸洗涤不足、脱水/透明过程不规范；

②处理建议：更换新鲜染液，适当延长流水与冰醋酸洗涤时间，严格控制脱水与透明时间。

（4）细胞核染色过深或过浅

①过深：缩短苏木精染色时间或加快分化；

②过浅：延长苏木精染色时间或优化蓝化步骤。

七、安全与废物处理

7.1操作安全

（1）所有酸性染料、磷钼酸、冰醋酸和有机溶剂操作时应佩戴手套和防护眼镜，并在通风良好环境中进行。

（2）避免染液和有机溶剂接触皮肤和黏膜，如有接触需立即用大量流水冲洗。

7.2废液处理

（1）含染料及强酸的废液应按实验室危险化学废物收集与处理规定集中处理，不得直接排入下水系统。