细胞培养基类型

一般而言，培养细胞需要无菌环境和支持细胞生长的营养供应。此外，培养环境的pH和温度应该是稳定的。在过去60年中，已经开发出成分确定的各种类型的培养基，现在均可商购获得。最初，平衡盐溶液用于维持哺乳动物心脏组织的收缩性，而Tyrode盐溶液则用于原代哺乳动物细胞。后来，这些原始的配方中添加了氨基酸、维生素、脂肪酸和脂质等营养素而被改良，因此，现代培养基适用于多种类型细胞的生长。精确的培养基配方通常通过优化每种成分的浓度来实现。下面给出了各种培养基及其应用。

表1各种培养基及其应用

基本细胞培养基成分

血清

血清是白蛋白、生长因子和生长抑制剂的复杂混合物，可能是细胞培养基中最重要的成分之一。最常用的血清是胎牛血清（FBS）。其他可用的血清类型包括新生小牛血清和马血清。血清的质量、类型和浓度均会影响细胞的生长，因此必须根据支持细胞生长的能力来筛选血清批次。此外，还有其他一些测试来选择血清批次，包括克隆效率、接种效率和细胞特性的保留。

血清还能够增加培养物的缓冲能力，这对于生长缓慢的细胞或接种密度低的情况（例如细胞克隆实验）会很重要。它还有助于防止在搅拌培养物或使用细胞刮刀时可能发生的机械损伤。

血清的另一个优点是适用于范围广泛的细胞类型，尽管在生长因子方面不同培养物的要求不同。此外，血清能够结合并中和毒素。然而，血清的批次之间存在差异，这使得生产方案的标准化变得困难。

使用血清还存在污染风险。从信誉良好的来源获取血清可以最大限度地降低这些风险，因为供应大量血清的供应商会执行一系列质量控制测试，并提供血清分析证书。具体而言，筛选细胞培养血清的一个目的是检查是否存在牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和支原体。血清的热灭活（在56 °C孵育30分钟）可以帮助降低污染的风险，因为一些病毒可被这个过程灭活，然而，这一过程还变性某些蛋白质和毁坏血清中的营养。随着现代血清生产方法的出现，常规使用热灭活血清已不再是细胞培养的必要条件。血清的使用还有成本问题，不仅是培养基配方成本，还有下游加工的成本。10％ FBS补剂可提供4.8 mg/mL蛋白质，这使得下游加工程序（例如蛋白质纯化）变得复杂。

血清使用指南

胎牛血清（FBS）已被用于制备许多生物制剂，并具有极好的安全记录。但自从1986年认识了牛海绵状脑病（BSE），后来该病传播到欧洲大陆，接着宣布BSE与人类克罗伊茨费尔特雅各布病的新变种之间可能存在联系，所有这些促使人们越来越关注所有牛的安全来源。1993年，美国食品和药物管理局（FDA）建议不要使用来自已经诊断出BSE的国家的牛源材料。

目前欧盟（EU）关于病毒安全的指南侧重于采购、测试并特别关注屠宰或收集原始组织期间交叉污染的潜在风险。关于BSE，欧盟关于降低BSE通过医药产品传播之风险的指导EMEA/410/01修订版3提出了建立牛材料安全性的主要措施。同样，关注的重点是地理来源、动物的年龄、育种和屠宰条件、将要使用的组织、以及加工条件。

在医药产品的生产过程中使用FBS是可以接受的，只要能够提交关于采购、动物年龄、确定不存在外来因子的测试的文件记录。所有为生物制药应用提供FBS的负责任的供应商，都应提供此类文件。

欧洲的法规要求强调了证明在药品生产中使用牛、山羊或绵羊原料的合理性的重要性。因此，尽管FBS已经在许多医药产品（例如病毒疫苗和重组DNA产品）的生产过程中使用多年，但目前有一种合理的趋势是从制造过程中去除所有动物来源的材料。我们已经认识到这一增长趋势，并与客户密切合作，优化无动物培养基配方，以满足每个客户的细胞培养要求。已经适应无血清培养基的无血清细胞系可从ECACC获得。

美国农业部（USDA）管制所有含有动物源成分的产品。美国农业部特别提到血清，已宣布对于属于其管辖范围的材料，只允许使用来自经批准的原产国的血清生产的生物制品进入美国。

血清的来源

ECACC仅使用来自BSE风险可忽略不计的国家的血清。历史上，来自澳大利亚、新西兰和美国的血清具有最低的BSE污染风险。检查所用血清的来源国及其BSE风险状态至关重要。如果血清的预期用途是用于生产运往美国的药用或其他产品，则使用具有适当质量的血清是尤其重要的。

来自信誉良好的供应商的血清应该已经过各种质量控制测试，这些测试会在产品信息表中列出。大多数血清产品都经过细胞培养测试，包括促生长、克隆效率和接种效率测试。

对血清进行的标准测试通常包括确定以下内容是否存在/或存在水平的测试：无菌性、病毒污染、支原体污染、内毒素、血红蛋白、总蛋白、免疫球蛋白、激素测试、pH（在室温下）和摩尔渗透压浓度。

无机盐类

培养基中含有无机盐是为了提供几种功能。盐主要是用钠、钾和钙离子建立和保持细胞的渗透平衡和调节膜电位。所有这些都是细胞基质中为了细胞附着所必需的，而且也是必要的酶辅助因子。

缓冲系统

大多数细胞需要7.2-7.4的pH条件，而且，通过密切控制pH对于优化培养条件十分必要。这个优化条件有几个较大的例外，成纤维细胞喜欢较高的pH（7.4-7.7），而连续转化的细胞系则需要更加酸性的条件。

在培养新的培养物时，接种细胞后应立即调节pH值，这点非常重要，而且一般用两种缓冲系统中的一种实现：（i）“天然”缓冲系统，其中气态CO2与培养基的CO3/ HCO3平衡；（ii）使用HEPES两性离子进行化学缓冲。

使用天然碳酸氢盐/CO2缓冲系统的培养物，需要在CO2培养箱中进行，其中的空气应含有5-10％的CO2。碳酸氢盐/CO2成本低，无毒，并且还为细胞提供其他化学营养。

HEPES在7.2-7.4的pH范围内具有优异的缓冲能力，但是相对昂贵，并且在较高浓度（高于~100 nM）下对某些细胞类型有毒。HEPES缓冲的培养物不需要受控的空气环境。

大多数商业培养基含有酚红作为pH指示剂，因此培养基的pH状态始终有颜色指示。通常，当颜色变为黄色（酸性）或紫色（碱性）时，应更换/补充培养基。

碳水化合物

这种能量的主要来源通常是糖类形式的碳水化合物。所使用的主要糖类是葡萄糖和半乳糖，但有些培养基则含有麦芽糖或果糖。糖的浓度从基础培养基中的1 g/L至一些更复杂培养基中的4.5 g/L不等。含有较高浓度糖的培养基能够支持更广泛细胞类型的生长。有些培养基的配方中含有丙酮酸盐，作为替代能量源。

氨基酸类

氨基酸是蛋白质的基本成分。必须在培养基中添加“必需”氨基酸，因为细胞本身无法合成这些氨基酸。培养基中氨基酸的浓度将决定可以达到的最大细胞密度 — 一旦耗尽，细胞将不再能增殖。

必需氨基酸对细胞培养极为重要。在液体培养基或原液中，谷氨酰胺会迅速降解。要想达到最佳细胞性能，一般在使用之前才给培养基补充谷氨酰胺。有些培养基配方包含更稳定的L-谷氨酰 谷氨酰胺，且不需要补充。

向培养基添加非必需氨基酸不仅可以刺激细胞生长，还可以延长培养基中细胞的活力。

维生素类

血清是细胞培养中维生素的重要来源。许多培养基还添加特定的氨基酸，是为了一贯地更适合更广泛的细胞系。维生素是许多辅因子的前体。许多维生素，尤其是B族维生素，对于细胞生长和增殖是必需的，对于某些细胞系，B12的存在是必需的。有些培养基还提高了维生素A和E的含量。常用于培养基的维生素包括核黄素、硫胺素和生物素。

蛋白质和肽

在无血清培养基中，适当的蛋白质和肽极为重要。最常用的蛋白质和肽包括白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白，用来替代含血清培养基中通常存在的蛋白质和肽。

脂肪酸和脂质

像蛋白质和肽一样，脂质和脂肪酸在无血清培养基中是重要添加剂，因为它们通常存在于血清中。例如胆固醇和类固醇这类大分子，它们是该类别中对特定细胞必不可少的。

微量元素

培养细胞的必需微量元素包括锌、铜、硒和三羧酸中间体等。硒是一种解毒剂，帮助清除氧自由基。

抗生素

在细胞培养中的使用最大限度地降低由于污染导致的宝贵细胞、试剂、时间和努力的损失。经验丰富的研究人员建议在培养细胞时使用足够浓度的经过细胞培养测试的抗生素。青霉素-链霉素是青霉素和链霉素的混合物，广泛用于哺乳动物细胞培养基中，用以防止细菌污染。某些抗生素，例如嘌呤霉素、新霉素和潮霉素，也用作选择剂，用于选择和建立用于研究目的转染/转基因的细胞。

培养基的制备

虽然成分确定的任何培养基可以由其组成成分制成，但对于大多数进行细胞培养的实验室来说，这样做很耗时，并且可能增加污染的风险。为方便起见，许可常用的培养基都是预混粉末或10x和1x液体培养基。我们的网上产品目录列出了所有常用培养基。如果使用的是粉末或10x培养基，用来溶解粉末或稀释浓缩液体的水是组织培养级的，不得含有矿物质、有机物和微生物污染物，包括热原质。在大多数情况下，通过逆渗滤和树脂滤芯等纯化技术生产的、最终电阻为16-18 MΩ的水是合适的。制备完成后，应正确调节培养基的pH，然后使用Stericup®过滤装置对培养基进行过滤除菌，才能使用。

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