多重免疫组化/多重免疫荧光（multiplex IHC / multiplex IF，简称mIHC）依托酪酰胺信号放大（Tyramide Signal Amplification，TSA）体系，可在同一张组织切片上实现多个蛋白靶标的高灵敏度空间共定位检测，特别适用于肿瘤免疫微环境评估、免疫治疗响应与耐药机制研究以及空间组学前期标志物筛选。TSA通过HRP催化酪酰胺荧光底物在靶蛋白周围共价沉积，在显著放大信号的同时保留良好的组织结构与空间信息；配合多轮抗体洗脱和不同波长酪酰胺底物，可构建3–9色多通道标记体系。阿拉丁3–9色多重荧光染色试剂盒以TSA-mIHC技术为基础，对FFPE及冰冻组织切片进行了系统优化，为常规病理实验室快速搭建多重荧光平台提供了标准化工具。

一、mIHC/多重荧光染色技术概述

         多重免疫荧光的核心目的是在同一块组织切片上同时解析细胞类型、功能状态和空间位置关系。以肿瘤免疫微环境为例，研究者往往希望在单张FFPE切片中同时观察肿瘤细胞标志、T细胞亚群、B细胞、髓系细胞以及PD-1/PD-L1、Ki-67等功能分子。如果仅依赖单色DAB或1–2色常规免疫荧光，需要多张连续切片，不仅消耗样本，而且受切片间异质性影响难以进行准确的空间统计。

         TSA-mIHC通过顺序多轮染色与共价沉积荧光信号，在一张切片上叠加多个标记通道，兼具空间分辨率和一定程度的定量能力，可直接对感兴趣细胞群进行多指标联合评估。

二、TSA酪酰胺信号放大原理

         在TSA-mIHC中，一轮典型染色过程可概括为：

1）一抗识别目标抗原，定位于细胞膜、胞质或胞核；

2）HRP标记二抗与一抗结合，将HRP酶定位于靶点周围；

3）加入含荧光酪酰胺的底物工作液，在H₂O₂存在下由HRP催化生成高活性自由基；

4）活化酪酰胺与邻近蛋白（多为酪氨酸侧链）共价键合，形成高密度荧光沉积；

5）使用特定洗脱缓冲液或热修复条件去除一抗和HRP二抗，保留已沉积的荧光信号；

6）更换新一抗和不同波长酪酰胺底物，进入下一轮染色。

         通过如此循环，可以在同一张切片上顺序累积3–9种不同波长的荧光信号，实现多标记共定位。TSA的关键优势在于信号来源于共价沉积，具有高灵敏度和高稳定性，信号不会在后续洗脱和处理过程中被轻易去除。

三、TSA-mIHC的优势

         相较传统免疫荧光，基于TSA的mIHC具有以下特点：

1）灵敏度高：适合检测低丰度靶标，对PD-L1、部分磷酸化蛋白等弱信号分子尤为有利。

2）空间信息完整：在单细胞水平上同时获得表达强度、定位和邻近关系。

3）节约样本：一张切片完成多靶点检测，适用于针吸活检、小鼠组织等样本量有限场景。

4）兼容性好：可用于常规FFPE组织、冰冻切片或细胞爬片，便于在现有病理流程上集成。

5）适配数字病理：多通道荧光图像可接入图像分析和空间统计软件，提高结果解读的客观性。

四、典型应用场景

1）肿瘤免疫微环境分析

在同一张肿瘤组织切片上同时标记肿瘤细胞、T细胞、B细胞、巨噬/树突状细胞及免疫检查点分子，可获得“细胞类型–功能标志–空间位置”三维信息，用于免疫微环境分型和疗效预测。

2）病理分型与诊断研究

针对某些形态相似、分子机制不同的疾病（如淋巴瘤亚型、肺癌不同驱动基因状态），mIHC可在有限的病理样本上同时评估多个诊断/预后标志物，提高组织利用效率。

3）信号通路与共定位研究

通过在同一细胞或组织区域内标记总蛋白与磷酸化蛋白、受体与配体、转录因子与下游靶点等，可进行空间共定位和通路激活状态的精细分析。

4）药物作用机制与伴随研究

在药物处理前后，对同一通路下多种标志物进行多重荧光检测，有利于解析药物作用环节、反馈调节和耐药相关变化，为候选标志物筛选和伴随诊断方法开发提供依据。

五、多色方案设计与阿拉丁3–9色多重荧光试剂盒布局

1.通道数量的选择

         阿拉丁多重荧光染色试剂盒覆盖从三色到九色不同通道数，便于用户根据项目复杂度进行逐级设计：

1）三色与四色适合作为入门方案，用于共定位验证、方法学建立，以及简单的“细胞类型+功能标志+核染”组合；

2）五色与六色适合大多数常规免疫微环境分析，例如同时标记肿瘤细胞、多类免疫细胞及1–2个功能分子；

3）七色及以上适合集成更多免疫亚群和通路标志，用于复杂微环境解析或高维panel开发。

         实验上可以先利用3–4色试剂盒优化抗原修复、一抗稀释和轮次顺序，再在参数稳定的基础上逐步升级至6–9色。

2.抗兔二抗与兔鼠通用二抗的选型

         本系列试剂盒根据二抗体系分为“抗兔二抗型”和“兔鼠通用二抗型”两类，对应不同的一抗组合策略：

1）当面板中全部或绝大多数一抗为兔源时，可优先选择抗兔二抗型试剂盒，体系更简洁，背景更容易控制；

2）当面板中同时存在兔源和小鼠源一抗，或未来可能扩展到混合物种抗体时，建议直接选择兔鼠通用二抗型试剂盒，以减少后期体系切换工作。

3.产品一览与应用定位

本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-700，TYR-780、TYR-650、TYR-540、TYR-690。

六、常见问题与排查思路

1）背景信号偏高时，可检查过氧化物酶封闭是否充分、封闭液是否合适，以及一抗稀释倍数是否偏低；必要时增加洗涤强度或考虑组织自发荧光淬灭步骤。

2）后几轮信号明显减弱时，需要评估抗体洗脱或再修复条件是否过于严苛导致抗原损伤，同时适当调整轮次顺序，将对条件敏感、表达较弱的靶标提前安排。

3）通道间光谱重叠或信号串色时，可重新规划荧光组合，将高丰度靶标安排在光谱相对独立的通道，同时在成像及分析阶段通过精确设置曝光和通道分离策略减轻干扰。

         基于TSA的mIHC多重荧光染色技术为在同一张组织切片上实现多标记空间检测提供了高灵敏度、高稳定性的解决方案。阿拉丁3–9色多重荧光染色试剂盒在通道数和二抗体系上进行了系统布局，既适合初次尝试多重染色的实验室逐步建立三色、四色方案，也支持有成熟抗体体系的团队快速扩展至六色甚至九色高维panel。通过在单标基础上优化抗原修复、一抗浓度和轮次顺序，并结合合适的抗兔或兔鼠通用二抗试剂盒选型，可以构建稳定、可重复的mIHC工作流程，为肿瘤免疫微环境解析、疾病分型和药物作用机制研究提供可靠的空间信息支持。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/