所需材料与试剂

在开始实验方案前，请确保以下材料已备齐：

• 乳蛋白（M1539127） — Aladdin Scientific封闭级粉末
• 含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）或含0.1% Tween-20的PBS（PBS-T）
• 硝酸纤维素（NC）或PVDF膜（用于蛋白质印迹）或微孔板（用于ELISA）
• 针对目标蛋白的一抗和二抗
• 摇床或轨道振荡器
• 计时器、量筒和分析天平
• 与二抗标记物兼容的检测底物（如用于化学发光检测的HRP底物）

将乳蛋白粉末存放于4°C密封容器中，防止吸潮和微生物污染。

乳蛋白封闭液的配制

封闭液的正确配制对于获得稳定结果至关重要。

1. 称量所需量的乳蛋白粉末。配制5%（w/v）溶液时，将5 g溶于100 mL TBS-T或PBS-T中。
2. 溶解：在室温下搅拌的同时缓慢加入粉末，搅拌10–15分钟至完全溶解。避免剧烈涡旋，以防产生过多泡沫。
3. 过滤：若溶液中可见颗粒物，用0.45 µm滤膜过滤，因未溶解的颗粒可能导致较高的背景信号。
4. 现配现用：封闭液应在使用当天新鲜配制，或在4°C下保存不超过24–48小时。请勿冷冻。
5. 若5%浓度在特定检测中产生不可接受的背景，可尝试降低背景，测试1–3%的乳蛋白溶液。

注意：进行磷酸化蛋白检测时，请用3–5% BSA替代乳蛋白，因牛奶中的酪蛋白本身为磷蛋白，可能与抗磷酸化抗体发生交叉反应。

封闭与抗体孵育分步操作流程

以下操作流程已针对蛋白质印迹进行优化，括号内注明了ELISA的调整方法。

1. 膜活化（仅限蛋白质印迹）：若使用PVDF膜，先在100%甲醇中预湿15–30秒，再在TBS-T中平衡5分钟。NC膜无需甲醇活化。
2. 封闭：将膜浸入新鲜配制的5%乳蛋白溶液中（ELISA时每孔加入200–300 µL封闭液），在室温下轻轻摇动孵育1小时，或于4°C过夜孵育。
3. 洗涤：去除封闭液，在摇床上用TBS-T（或PBS-T）洗涤3次，每次5分钟。
4. 一抗孵育：将一抗按推荐浓度稀释于1–5%乳蛋白溶液中（磷酸化靶标使用BSA）。在室温下轻摇孵育1小时，或于4°C过夜孵育。
5. 洗涤：用TBS-T洗涤3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。
6. 二抗孵育：将合适的HRP或荧光素标记二抗稀释于1–5%乳蛋白溶液中。在室温下轻摇孵育1小时，若使用荧光二抗需避光操作。
7. 最终洗涤：用TBS-T洗涤3次，每次5–10分钟，再用不含Tween的TBS洗涤1次，共5分钟，然后进行检测。
8. 检测：加入适当的检测底物（如HRP的ECL试剂），使用化学发光成像仪或X射线胶片成像。

常见问题排查

请参考下表诊断和解决使用乳蛋白作为封闭剂时常见的问题。

储存、安全及法规说明

储存：将乳蛋白（M1539127）储存于4°C密封容器中，避免潮湿和直射光。请勿冷冻。在推荐条件下，产品稳定性以产品标签标注为准。请务必查阅批次特定信息的质量检验报告（CoA）。

安全性：乳蛋白源自牛乳，在正常实验室操作条件下通常被认为无危害。然而，已知对乳制品过敏的人员应谨慎操作，并佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套和护目镜。完整危害信息请参阅Aladdin Scientific提供的安全数据表（SDS）。

质量与纯度：仅供研究用途，不适用于诊断或治疗目的。批次特定的纯度和质量数据载于CoA中，可向Aladdin Scientific索取或通过产品页面获取。

废物处置：乳蛋白溶液及受污染材料的处置应符合当地机构及政府法规。