内质网通过分子伴侣、内质网相关降解和内质网自噬维持蛋白质稳态。可解折叠的异常蛋白主要经ERAD逆向转位并由蛋白酶体降解，大型聚集体及异常内质网片段则更多通过ER-phagy进入溶酶体。当错误折叠蛋白负荷持续超过清除能力时，未折叠蛋白反应可由适应性调节转向炎症和细胞死亡。

        关键词：内质网应激；未折叠蛋白反应；内质网相关降解；ERAD；ER-phagy；HRD1；SEL1L；VCP；蛋白酶体；细胞死亡

1 内质网蛋白质量控制与应激反应

1.1 内质网蛋白折叠环境

        进入分泌途径的蛋白在内质网中完成N-糖基化、二硫键形成、亚基组装和构象成熟。BiP、钙联蛋白、钙网蛋白及蛋白二硫键异构酶家族共同识别新生肽链中的疏水区、未配对半胱氨酸和异常糖链结构。内质网腔内的氧化还原状态、钙离子浓度和分子伴侣容量均会影响蛋白折叠效率；缺氧、营养缺乏、钙稳态破坏、氧化应激及分泌负荷增加均可造成错误折叠蛋白积累。

1.2 未折叠蛋白反应

（1）PERK信号通路

        PERK通过磷酸化eIF2α暂时降低整体蛋白翻译，减少新生肽链进入内质网，同时促进ATF4相关应激基因表达。在短期应激条件下，该通路主要用于降低蛋白折叠负荷并提高细胞适应能力。

（2）IRE1α信号通路

        IRE1α通过剪接XBP1 mRNA形成XBP1s，促进分子伴侣、脂质合成及ERAD相关基因表达，从而扩大内质网折叠和降解能力。IRE1α还可通过调控性IRE1依赖性mRNA降解改变进入内质网的蛋白负荷。

（3）ATF6信号通路

        ATF6在应激条件下由内质网转运至高尔基体，经蛋白水解释放具有转录活性的胞质片段。活化的ATF6进入细胞核后诱导分子伴侣、折叠酶和部分ERAD组分表达，与PERK和IRE1α共同促进蛋白质稳态恢复。

1.3 错误折叠蛋白的主要清除途径

        内质网相关降解（ER-associated degradation，ERAD）主要处理可被解折叠并跨越内质网膜的单体蛋白或小型复合物，其终点是胞质泛素-蛋白酶体系统。内质网自噬（ER-phagy）则将特定内质网膜区段及其中的蛋白聚集体递送至溶酶体，更适合清除难以逆向转位的大型聚集体、膜结构异常和过量内质网。两条途径并非相互替代，而是根据底物构象、聚集状态和所在内质网亚区进行分工。

表1 内质网蛋白质量控制的主要清除途径

2 ERAD底物的识别与筛选

2.1 糖蛋白折叠监控

        寡糖转移酶可将Glc₃Man₉GlcNAc₂寡糖转移至新生肽链的Asn-X-Ser/Thr位点，其中X通常不能为脯氨酸。糖链经葡萄糖苷酶逐步修剪后，单葡萄糖化糖蛋白进入钙联蛋白—钙网蛋白循环。若蛋白尚未正确折叠，UDP-葡萄糖-糖蛋白葡萄糖基转移酶可重新添加葡萄糖，使其再次进入伴侣折叠循环；正确折叠的蛋白则离开内质网并进入后续分泌途径。

2.2 甘露糖修剪与降解标记

        长期不能折叠的糖蛋白可经MAN1B1及EDEM家族蛋白进行甘露糖修剪。特定甘露糖残基暴露后形成进入ERAD的糖链信号，OS-9和XTP3-B通过甘露糖-6-磷酸受体同源结构域识别此类修剪糖链，并将底物递交给SEL1L-HRD1复合物。甘露糖修剪不是简单的脱糖基过程，而是将反复折叠失败的糖蛋白从钙联蛋白—钙网蛋白循环转入降解通路的重要计时机制。

2.3 非糖基化底物的识别

        非糖基化蛋白不能依赖糖链降解标记，通常由BiP及其他伴侣蛋白识别其暴露疏水区、异常组装界面或长时间未折叠状态。OS-9和XTP3-B也可影响部分非糖基化底物的降解，但二者对糖链和非糖链降解信号的作用并不完全相同，因此不能将所有非糖基化ERAD底物归入单一伴侣途径。

2.4 二硫键还原与底物解折叠

        许多分泌蛋白依靠二硫键维持稳定构象，错误折叠蛋白若保留复杂二硫键结构，将难以通过逆向转位通道。ERdj5可与EDEM和BiP协同，减少错误或非天然二硫键，使底物由紧凑构象转变为适合转位的状态。ERdj5的J结构域还能促进BiP的ATP酶循环，使BiP稳定结合已被还原的底物并防止其重新聚集。

图1 内质网相关降解（ERAD）介导的错误折叠蛋白清除过程

3 ERAD底物的逆向转位

3.1 SEL1L-HRD1复合物

        SEL1L是连接内质网腔内底物识别系统与膜上E3泛素连接酶HRD1的核心支架。其腔内区域可与OS-9、XTP3-B和其他伴侣蛋白形成复合物，膜侧则与HRD1及Derlin蛋白协同，将被判定为不可修复的底物递送至逆向转位装置。缺失SEL1L会破坏HRD1复合物稳定性，并显著降低多类腔内ERAD底物的清除效率。

3.2 逆向转位通道

（1）HRD1介导的膜转位

        HRD1既是E3泛素连接酶，也是逆向转位复合物的重要膜组分。其跨膜区可形成具有亲水内部环境的通道，为部分腔内或膜内错误折叠底物退出内质网提供路径。

（2）Derlin及其他膜组分的协同

        Derlin家族蛋白可根据底物类型参与异常跨膜区识别、膜插入、底物递交或逆向转位复合物组装。不同ERAD复合物分别处理腔内结构异常、跨膜区异常或胞质结构域异常的底物。

（3）Sec61作用的局限性

        早期模型认为Sec61可能承担部分ERAD底物的逆向转位，但目前不能将其视为所有哺乳动物ERAD底物的统一转位通道。Sec61是否参与具体底物降解，取决于底物类型、细胞环境和相关ERAD复合物组成。

3.3 底物构象与转位效率

        逆向转位通常要求底物至少部分解折叠。过大的寡聚体、稳定聚集体或高度交联的糖蛋白难以通过ERAD通道，可能滞留在内质网并转入ER-phagy或其他溶酶体清除途径。膜蛋白则可能先发生异常跨膜区识别，再由HRD1、gp78或其他E3连接酶完成泛素化和膜上提取。

4 ERAD底物的泛素化、提取与蛋白酶体降解

4.1 泛素化级联

（1）泛素活化

        E1泛素激活酶利用ATP活化泛素，并在E1活性半胱氨酸与泛素C端之间形成高能硫酯键。

（2）泛素转移

        活化的泛素随后由E1转移至E2泛素结合酶的活性半胱氨酸。不同E2可与特定内质网膜E3连接酶协同，影响泛素链类型和延伸效率。

（3）底物泛素化

        E3泛素连接酶同时识别E2和底物，促进泛素C端甘氨酸与底物赖氨酸形成异肽键。ERAD底物通常形成K48连接的多聚泛素链，但部分底物也可携带混合或分支泛素链。

4.2 ERAD相关E3连接酶

        HRD1是腔内和部分膜内异常底物降解的核心E3连接酶。其他参与内质网蛋白质量控制的E3还包括gp78/AMFR、MARCHF6/TEB4、RNF5、RNF170、RNF185和TRC8/RNF139等。不同E3在底物定位、组织分布和应激状态方面存在分工，不能将所有内质网底物的泛素化均归因于HRD1。

4.3 VCP/p97介导的底物提取

        VCP/p97是AAA+ ATP酶，可与UFD1-NPL4复合物结合并识别多聚泛素化底物。p97利用ATP水解产生的机械力，将底物从内质网膜或膜蛋白复合物中分离并拉入胞质。UBXD2、UBXD8、VIMP及其他辅助蛋白可将p97募集到特定ERAD复合物，而YOD1、Ataxin-3等去泛素酶则调节泛素链长度和底物通过p97中央通道的效率。

4.4 去糖基化与蛋白酶体降解

        逆向转位的糖蛋白可在胞质中被NGLY1去除N-糖链，并伴随糖基化天冬酰胺向天冬氨酸的转换。去糖基化可降低底物体积并促进蛋白酶体处理，但NGLY1并非所有ERAD底物降解的绝对必要组分。完成必要的解折叠、去糖基化及泛素链调整后，底物被26S蛋白酶体的19S调节颗粒识别并送入20S核心颗粒水解。

表2 ERAD的主要步骤与核心分子

5 ER-phagy介导的内质网清除

5.1 ER-phagy的底物范围

        ER-phagy是选择性自噬的一种，可将特定内质网膜片段及其中的腔内蛋白、膜蛋白和聚集体递送至溶酶体。对于不能充分解折叠、无法逆向转位或形成大型聚集结构的底物，ER-phagy可作为ERAD的重要补充。错误折叠前胶原等蛋白即可通过钙联蛋白与FAM134B形成的质量控制复合物进入溶酶体清除。

5.2 ER-phagy受体

（1）片层内质网相关受体

        FAM134B/RETREG1主要定位于内质网片层边缘，可通过网状蛋白同源结构域增加膜曲率，并通过LC3相互作用区招募自噬膜。CCPG1也可参与分泌细胞中内质网片层及错误折叠蛋白的清除。

（2）管状内质网相关受体

        RTN3L、ATL3和TEX264更多参与管状内质网的选择性清除。RTN3L和ATL3与内质网膜弯曲及网络重塑有关，TEX264则是营养缺乏条件下ER-phagy通量的重要调控因子。

（3）应激恢复相关受体

        SEC62与应激解除后的内质网重塑密切相关，可通过LC3相互作用基序促进扩张内质网的溶酶体清除，使细胞恢复基础内质网容量。

5.3 内质网膜分离与溶酶体递送

        ER-phagy不仅需要识别底物，还必须使连续的内质网网络发生局部弯曲、断裂和分离。FAM134B和RTN3L的网状蛋白同源结构域可增加膜曲率，Atlastin家族GTP酶则参与内质网膜重塑和片段分离。形成的内质网片段被隔离膜包裹，随后形成自噬体并与溶酶体融合，使膜和腔内底物共同降解。

5.4 恢复性ER-phagy

        未折叠蛋白反应可引起内质网扩张，以提高蛋白折叠和脂质合成能力。应激解除后，多余内质网需要被清除以恢复正常结构，这一过程常称为恢复性ER-phagy或recovER-phagy。SEC62可在应激恢复阶段通过LC3相互作用基序促进多余内质网进入溶酶体，使细胞从扩张的应激状态恢复至基础水平。

表3 ERAD与ER-phagy的功能比较

6 持续内质网应激与细胞死亡

6.1 PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路

（1）短期适应性调节

        短暂PERK活化可通过抑制整体翻译减少新生蛋白进入内质网，同时促进氨基酸代谢、抗氧化反应和应激恢复相关基因表达，有利于细胞维持蛋白质稳态。

（2）持续应激下的死亡信号

        长期PERK-eIF2α-ATF4信号可持续诱导CHOP。CHOP可调节BCL-2家族、氧化还原稳态和死亡受体5表达，使细胞由降低负荷的保护状态转向线粒体凋亡及死亡受体相关凋亡。PERK通路的生物学结果取决于信号持续时间、强度和细胞类型。

6.2 IRE1α信号的双重作用

（1）XBP1s介导的适应性反应

        IRE1α介导的XBP1剪接通常有利于提高内质网折叠、脂质合成和ERAD能力，使细胞能够处理短期增加的分泌负荷和错误折叠蛋白。

（2）持续IRE1α信号与细胞损伤

        持续或高强度IRE1α寡聚化可增强调控性IRE1依赖性mRNA降解，并通过TRAF2、ASK1和JNK等通路促进炎症及细胞死亡。STF-083010和4μ8C可直接抑制IRE1α RNase活性，而KIRA类化合物通过结合其激酶结构域变构降低RNase输出。4μ8C还具有活性氧清除作用，高浓度实验结果不能全部归因于IRE1α抑制。

6.3 钙稳态破坏与线粒体凋亡

        内质网钙耗竭会降低钙依赖性分子伴侣的折叠能力，并增加内质网向线粒体的异常钙转移。线粒体钙超载可促进活性氧生成、膜电位下降和细胞色素c释放，进而激活Caspase-9和Caspase-3。内质网应激相关炎症和凋亡研究中还常检测人Caspase-4或啮齿动物Caspase-12，但两者不能在不同物种之间直接等同。

6.4 自噬的保护与损伤效应

        适度自噬可通过清除聚集蛋白、受损内质网和异常线粒体提高细胞存活率；当应激持续、溶酶体容量不足或自噬通量受阻时，自噬体积累可能与细胞死亡共同出现。观察到LC3-II升高并不能直接说明自噬降解增强，也可能反映自噬体与溶酶体融合受阻，因此需要结合溶酶体抑制剂及通量检测进行判断。

7 内质网应激、ERAD与ER-phagy研究产品

7.1 内质网应激诱导与UPR信号调控产品

7.2 ERAD、蛋白酶体与ER-phagy研究产品

        ERAD主要清除能够逆向转位的异常蛋白，ER-phagy则处理大型聚集体和异常内质网片段。二者与UPR共同决定细胞能否恢复蛋白质稳态；当持续应激超过其代偿和清除能力时，细胞将逐步转向炎症及不可逆死亡。

参考文献

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[1] 泛素系统的结构编码与蛋白质稳态调控机制