MTT比色法是一种基于细胞代谢活性的检测方法，广泛用于细胞生物学和药理学研究中，用于评估细胞增殖、细胞活性、细胞毒性以及药物筛选等。

           MTT比色法的核心原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐）（黄色）还原为不溶于水的蓝紫色结晶物——甲瓒（Formazan）。死细胞由于缺乏这种还原能力，无法形成甲瓒结晶。通过加入二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒结晶，并在酶标仪上测定其在490 nm或570 nm波长处的光吸收值（OD值），可以间接反映活细胞的数量。在一定细胞数量范围内，甲瓒结晶形成的量与活细胞数成正比。

第 1 阶段   MTT溶液制备

           MTT在水、乙醇以及缓冲盐溶液和培养基等溶剂中都具有可溶性，一般情况下，我们建议使用PBS溶剂，制备5 mg/mL MTT溶液。

1.将MTT溶解于PBS中，制备5 mg/mL的MTT溶液。

2.使用涡旋振荡器或超声处理确保MTT完全溶解。

3.使用0.22 µm滤膜过滤灭菌。

4.将MTT溶液分装后，置于-20℃保存（可稳定保存至少6个月）。

           注意：

           MTT溶液需要现用现配，避免反复冻融。

           推荐灭菌过滤后的MTT溶液（防止微生物降解）。

第2阶段   细胞准备和处理

1.准备细胞样本。

         贴壁细胞：将对数生长期的细胞消化后，调整细胞浓度为5×10³- 1×104个/孔，接种于96孔板，每孔100 µL。

         悬浮细胞：将细胞浓度调整为1×10⁶/mL，每孔加入100 µL细胞悬液（含1×104个细胞）。

2.根据实验需求，向培养基中加入不同浓度的药物，预留空白孔（仅培养基）、对照孔和处理组。

3.将96孔板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育16-48小时。

第 3 阶段   MTT染色

          培养基中存在的血清或酚红会产生背景。如果您的样品含有血清或酚红，请设置样品背景对照：50 µL MTT试剂 + 50 µL细胞培养基（无细胞）。

          准备平行孔作为溶剂对照，并使用与处理细胞相同体积的溶剂。

1.去除细胞培养中的培养基。

         对于贴壁细胞，小心地吸出培养基。

         对于悬浮细胞，在4°C下将96孔板在微孔板兼容离心机中以 1,000 × g的速度离心5分钟，然后小心地吸出培养基。

2.每孔加入50 µL无血清培养基和50 µL MTT溶液，轻轻混匀。

3.将孔板置于37℃培养箱中孵育3-4小时，直至出现明显的蓝紫色结晶。

4.孵育后，向每个孔中加入 150 µL MTT溶剂（含4 mM HCl，0.1% NP40的异丙醇溶液）。

5.用箔纸包住培养皿，并放在定轨振荡器上振荡15分钟。

6.使用酶标仪读取OD=590 nm处各孔的吸光度。从测定读数中减去培养基背景。这就是校正后的吸光度。吸光度的多少与细胞数量成正比，使用校正后的吸光度可计算细胞增殖率或细胞毒性。

          注意：尽量1小时内读板。

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