NF-KB p105 小鼠单克隆抗体：筛选与应用指南
NF-KB p105 小鼠单克隆抗体：筛选与应用指南
NF-KB p105 Mouse mAb是一种专门针对NF-κB p105前体蛋白制备的单克隆抗体，旨在多种免疫学检测格式中可靠检测并功能性分析这一关键转录因子亚基。
- 产品货号
- Ab349141
- 抗体类型
- 鼠源单克隆抗体（mAb）
- 靶标蛋白
- NF-κB p105（NFKB1基因产物；p50的前体蛋白）
- 推荐应用
- 蛋白质印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）、免疫沉淀（IP）
- 生物学意义
- NF-κB p105既是NF-κB亚基的前体，又具有类IκB抑制功能，是炎症和免疫信号传导的核心分子
- 宿主物种
- 小鼠
背景：NF-κB p105在细胞信号传导中的作用
NF-κB（核因子κB）是一类转录因子家族，调控参与炎症、免疫、细胞存活和增殖的基因。p105蛋白由NFKB1基因编码，在NF-κB家族成员中具有独特的双重功能：一方面，它是p50亚基的全长前体，通过组成型或信号诱导型蛋白酶体加工产生p50；另一方面，它通过C端锚蛋白重复结构域独立发挥类IκB抑制剂的作用，将NF-κB复合物锚定于细胞质中。
在适当刺激下（如细胞因子TNF-α、IL-1β，脂多糖LPS或抗原受体激活），p105发生信号诱导性降解或加工，释放含p50的二聚体并转位至细胞核，激活靶基因转录。因此，p105/p50轴是经典和非经典NF-κB信号通路中的关键调控节点，针对p105的抗体是解析通路激活状态不可或缺的工具。
抗体规格与验证
NF-KB p105鼠单克隆抗体（货号：Ab349141）是一种鼠源单克隆抗体，与多克隆抗体相比具有更高的特异性和批次间一致性。主要规格注意事项如下：
- 同型：请参阅随附说明书确认IgG同型，以选择合适的二抗。
- 免疫原：通常针对p105序列中的特定表位；表位位置（N端、中央或C端）决定该抗体是同时识别p105和加工产物p50，还是仅识别p105。详情请参阅产品说明书。
- 特异性：通过在蛋白质印迹中使用适当阳性对照裂解液（如经LPS或TNF-α刺激的Jurkat、HeLa或RAW264.7细胞），观察预期分子量处的条带（p105约105 kDa；若表位位于共享N端区域则p50约50 kDa）进行验证。
- 交叉反应性：请查阅说明书了解已确认的物种交叉反应性（人、小鼠、大鼠）。单克隆抗体的交叉反应范围可能窄于多克隆抗体。
本文所引用的所有Aladdin Scientific抗体对应供应商目录编号absea#KC-18067。研究人员在实验使用前应始终对照当前产品说明书核实规格信息。
各应用的推荐实验方案
以下应用特异性指导适用于Ab349141。请始终通过梯度稀释法，使用您实验室特定的细胞或组织裂解液确认最佳工作浓度。
蛋白质印迹（WB）
- 使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。在NF-κB通路研究中，应加入磷酸酶抑制剂（如正钒酸钠、氟化钠）以保留磷酸化状态。
- 在7.5–10% SDS-PAGE凝胶上分离20–40 µg总蛋白（p105约105 kDa；p50约50 kDa）。
- 转膜至PVDF膜，室温用含5%脱脂奶粉或BSA的TBST封闭1小时。
- 按制造商推荐稀释比例加入一抗，4°C孵育过夜。
- 用TBST洗涤3次，加入HRP标记的抗鼠二抗，用ECL法显色检测。
- 阳性对照裂解液：LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞或TNF-α刺激的HeLa细胞。
免疫组织化学（IHC）
- 用10%中性缓冲福尔马林固定组织并石蜡包埋（FFPE）。对于核/细胞质靶标，通常需在柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中进行热诱导抗原修复（HIER）。
- 用3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶10分钟。用二抗宿主物种的正常血清（5–10%）封闭非特异性结合。
- 按推荐稀释比例加入一抗；在湿盒中室温孵育1小时或4°C孵育过夜。
- 使用适配物种的HRP聚合物二抗系统和DAB显色剂检测，苏木精复染。
免疫沉淀（IP）
- 在温和裂解液（如含抑制剂的PBS中0.5% NP-40）中裂解细胞，以保留蛋白质-蛋白质相互作用。
- 用蛋白A/G琼脂糖珠在4°C预清除裂解液1小时。
- 每500 µg总蛋白加入Ab349141 1–5 µg，4°C旋转孵育过夜。
- 用蛋白A/G珠捕获免疫复合物，用裂解液洗涤3–5次，在SDS上样缓冲液中洗脱，并通过WB分析。
储存、处理与质量控制
适当的储存和处理对于维持抗体活性并确保实验结果的重现性至关重要：
- 储存温度：长期储存于–20°C。避免反复冻融；如预计多次使用，收货后应立即分装。
- 短期储存：1–2周内使用的工作液可储存于4°C。避免在4°C长期储存，否则可能导致聚集和活性丧失。
- 载体蛋白：若配方中含有BSA或甘油，请确认其与下游应用的兼容性（BSA可能干扰某些邻近连接或质谱实验）。
- 无菌操作：分装时保持无菌操作。若抗体用于基于细胞的功能实验，应避免使用含叠氮化钠的配方，因叠氮化钠具有细胞毒性。
- 批次间一致性：务必记录批次号。更换批次时，在开展大规模实验前应进行并行验证蛋白质印迹实验。
出于质量控制和法规合规目的，请保留实验中使用的每个批次的质量检验证书（CoA）。
常见问题排查
下表总结了使用抗p105单克隆抗体时常见问题及推荐纠正措施：
| 问题 | 可能原因 | 推荐措施 |
|---|---|---|
| WB未检测到条带 | 抗原含量不足、分子量范围错误或抗体降解 | 确认阳性对照裂解液表达p105（使用刺激后的免疫细胞）；核实凝胶浓度（7.5–10%）；检查抗体储存情况 |
| 出现多条非特异性条带 | 抗体浓度过高或封闭不充分 | 降低抗体浓度；延长封闭时间或改用BSA封闭；在洗涤缓冲液中加入0.1% Tween-20 |
| IHC背景偏高 | 内源性过氧化物酶淬灭不充分或二抗非特异性结合 | 延长H₂O₂淬灭步骤；优化血清封闭；每次实验设置阴性对照（不加一抗） |
| IP拉下效率低或无结果 | 天然状态下表位被掩盖或抗体用量不足 | 优化裂解缓冲液严格程度；增加抗体用量；IP前先通过直接WB确认靶标表达 |
常见问题
Ab349141能否通过蛋白质印迹同时检测p105和p50？
Ab349141是否能检测到p50（p105的蛋白水解加工产物，约50 kDa）取决于其免疫原表位的位置。若表位位于p105和p50共有的N端区域，两条条带均可能显现；若表位位于p105特有的C端锚蛋白重复结构域，则仅出现约105 kDa的条带。请查阅产品说明书获取已确认的表位信息。
哪些细胞系适合作为NF-κB p105检测的阳性对照？
具有高NF-κB通路活性的细胞系是理想的阳性对照。Jurkat（人T细胞白血病）、HeLa（人宫颈癌）和RAW264.7（小鼠巨噬细胞）细胞均内源性表达NF-κB p105，可进一步用TNF-α（10–20 ng/mL）或LPS（1 µg/mL）刺激，以增强p105表达并观察其向p50的加工过程。始终设置未刺激对照泳道以供比较。
Ab349141是否适用于流式细胞术或ELISA？
产品来源资料未确认Ab349141经流式细胞术或ELISA验证。在未经验证的应用中使用抗体可能产生不可靠的结果。在尝试未经测试的应用格式之前，请联系Aladdin Scientific技术支持，咨询已验证的应用范围并索取相关验证数据。
在开展大规模实验前，如何验证Ab349141新批次？
使用相同的阳性对照裂解液和抗体稀释比例，对新批次与之前已验证批次进行并行蛋白质印迹实验比较。确认条带强度、分子量和特异性特征一致。将批次号、使用稀释比例和结果记录在实验记录本中，作为质量控制档案的一部分。
p105磷酸化在NF-κB信号传导中有何意义？
p105的磷酸化主要发生在其PEST结构域内的丝氨酸残基上（如人类序列中的Ser927和Ser932），由IKKβ在受到刺激后介导，使p105被泛素化并经蛋白酶体降解或加工，从而释放含p50的二聚体和游离的NF-κB亚基。将磷酸化特异性抗体与Ab349141等总p105抗体联合使用，可帮助研究人员区分总蛋白水平与激活相关的加工事件。
参考文献
- Hayden MS, Ghosh S. NF-κB, the first quarter-century: remarkable progress and outstanding questions. Genes Dev. 2012;26(3):203-234. doi:10.1101/gad.183434.111
- Moorthy AK, Bhatt DL, Bhatt D, et al. IκB kinase-induced p105 processing controls NF-κB activation and signaling specificity. EMBO J. 2006;25(21):4975-4985.
- Aladdin Scientific. Product Datasheet: NF-KB p105 Mouse mAb, Ab349141 (absea#KC-18067). Aladdin Scientific; [date on file].
- Ghosh S, Hayden MS. New regulators of NF-κB in inflammation. Nat Rev Immunol. 2008;8(11):837-848. doi:10.1038/nri2423
产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。
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