在生物制药工艺和高灵敏分子检测体系中，核酸及核酸酶的“存在形式”和“控制方式”直接决定了工艺的可制造性、产品安全性以及分析结果的可信度。高分子DNA/RNA会显著改变体系流变特性、干扰纯化分离并引入宿主残留风险；痕量DNase/RNase则足以破坏核酸类药物和测序文库的完整性，或在PCR/qPCR等体系中造成难以溯源的假阴性/假阳性。因此，有必要将“核酸/核酸酶清除”从零散经验操作，系统上升为可设计、可验证、可放大的工程模块。

一、基本概念

1.1概念区分

在生物制药和分子生物学实验体系中，“核酸/核酸酶清除”实质上涉及两类性质不同的控制目标：

（1）核酸（DNA/RNA）清除

指通过降解、分离或吸附等方式降低游离或结合态核酸的含量，核心目的包括：

①降低细胞裂解液黏度，改善搅拌、离心、过滤和层析等单元操作的工艺性能；

②去除宿主细胞残留DNA（host cell DNA，HCDNA），满足药典或法规限度；

③降低核酸–蛋白/颗粒复合物对下游分析、制剂稳定性和安全性的干扰。

（2）核酸酶（nuclease）清除

指降低或消除DNase/RNase活性，以保护目标核酸（质粒DNA、mRNA、siRNA、病毒基因组、测序文库等）免受降解。主要目的包括：

①构建接近RNase-free/DNase-free的操作环境；

②在核酸类药物工艺中控制外源或宿主来源核酸酶污染；

③防止上游添加的工艺核酸酶残留至下游关键步骤。

1.2体系内与环境/表面两个维度

从载体形态可进一步区分：

（1）体系内核酸/核酸酶控制

针对发酵上清、细胞裂解液、中间体溶液、缓冲液等液相体系中的核酸及核酸酶。

（2）固相表面与环境控制

针对实验台面、仪器外壳、移液器、离心机腔体、耗材表面等固体界面上吸附与干燥状态的核酸和核酸酶污染，是防止假阳性扩增和RNase交叉污染的关键。

后续内容分别围绕上述两个维度展开。

二、核酸去除：从“剪切降黏”到“工艺抛光”的技术路径

2.1核酸酶降解：长链核酸向小片段转换

（1）基本原理

在细胞裂解或粗澄清后加入非特异性DNase、RNase或广谱内切核酸酶，将高分子DNA/RNA切割为较短核酸片段（寡核苷酸），显著降低黏度并改善后续单元操作的流变特性和传质特性。

（2）关键工艺参数

①金属离子依赖性

大多数内切核酸酶依赖Mg²⁺/Mn²⁺等二价金属离子，体系中若存在EDTA等螯合剂会显著抑制酶活。工艺设计需统筹螯合剂用量与核酸酶使用窗口。

②底物可及性

当核酸以核蛋白复合物、膜结合或衣壳包裹形式存在时，核酸酶难以有效接触，通常需要通过：

表面活性剂或温和去污剂裂解结构；

调整离子强度/pH改善溶解与解离；

机械破碎提高暴露度。

③反应条件与时间

温度、pH、离子强度和作用时间共同决定降解程度。生产中通常需在“黏度显著下降”和“残留核酸可被后续单元进一步去除”的平衡点上确定工艺窗口。

（3）典型应用

①重组蛋白/抗体下游：裂解或澄清前后降低黏度，提高离心、过滤和层析的通量与可控性；

②病毒载体/病毒样颗粒：降低宿主核酸残留和黏度，减轻色谱及膜分离负荷；

③高密度细胞培养终止后处理：改善大体积体系的流动性和混合效率。

2.2吸附与沉淀：利用核酸高负电荷与聚阴离子特性

（1）带正电材料吸附

核酸在中性条件下以高密度负电荷形式存在，可通过：

①阴离子交换色谱（anion exchange chromatography, AEX）

利用核酸与树脂官能团之间的静电作用，实现核酸结合与目标分子流穿，或相反模式。

②正电荷功能化载体或多聚阳离子表面

通过表面正电荷吸附游离核酸或核酸–蛋白复合物，用于前处理和在线除核酸模块。

工艺风险在于：若目标分子等电点较高或带明显负电，也可能发生共吸附，从而影响收率，需要通过pH、电导和梯度优化建立分离窗口。

（2）多聚阳离子沉淀

利用聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）等多聚阳离子与核酸形成不溶性复合物，适用于大体积裂解液的前处理。

①优点：可显著降低核酸负荷和黏度，工艺放大相对简单；

②风险：剂量过高或条件不当时易将带负电的蛋白、多聚阴离子和颗粒一并拖入沉淀，造成收率和活性损失，需要借助在线电导/pH监控和规模化设计实验确定稳健操作区间。

2.3物理分离单元：以尺寸与电荷差异为基础的抛光

（1）超滤/透析（UF/DF）

对于已被核酸酶剪切为小片段的核酸，可利用UF/DF膜分离实现去除；但对于未降解的高分子DNA，超滤更容易引起膜污染和跨膜压快速上升。因此工程实践中多采用“酶解预处理+UF/DF抛光”的组合策略。

（2）层析抛光

①AEX抛光：在终抛光层析中，通过优化负载量、盐梯度和pH，可将残余核酸与目标蛋白/颗粒分离，并满足宿主DNA残留限度；

②SEC：通过体积排阻获得部分核酸及其复合物的额外去除能力，但通量和载量有限，多用于分析和小规模制备。

三、核酸酶清除：失活、去除与系统性防控

3.1核酸酶失活：基于结构与催化机理的抑制

（1）金属依赖型核酸酶

对依赖二价金属离子的核酸酶，使用EDTA等螯合剂可竞争结合金属离子，从而抑制催化活性。此策略适用于多类非特异性内切核酸酶，但对不依赖金属的RNase（如RNase A家族）或对金属亲和力极高的酶类效果有限。

（2）蛋白质变性与构象破坏

通过高温处理、变性剂（胍盐、尿素）或阴离子去污剂可破坏核酸酶的天然构象，使其失去催化活性。工艺设计需评估：

①对目标核酸的二级结构和功能的影响；

②对后续酶反应体系（逆转录、PCR、连接、体外转录等）的兼容性。

（3）极高稳定性RNase的控制

部分RNase具有高热稳定性和多重二硫键，仅依靠温和加热或短时处理不足以完全失活。因此在RNA相关工艺与实验中，更应强调源头防控（区域隔离、专用耗材、表面去污染）和迁移阻断，而不是试图通过单一“终端失活步骤”解决全部问题。

3.2核酸酶的工艺性去除

（1）层析与膜分离

利用核酸酶与目标核酸在分子量、等电点和疏水性上的差异，可在层析和UF/DF单元中实现分离：

①AEX/HIC等色谱

通过条件优化，使核酸酶结合、核酸流穿，或相反模式。对上游使用的外源核酸酶尤其适用。

②UF/DF

根据核酸酶蛋白与核酸的相对分子质量选择合适截留分子量，通过浓缩/透析实现部分核酸酶去除。

（2）亲和和特异性吸附

若外源核酸酶带有特异标签或表面表位，可设计亲和层析或特异吸附材料进行针对性去除，提高残留控制的可预测性。

3.3RNase污染控制的系统工程

（1）设施与物料管理

①RNA专用区域、专用移液器、离心机转头和耗材；

②全流程使用经验证的RNase/DNase-free水和缓冲液。

（2）环境与固相表面控制

①对PCR工作台、超净工作台、冰盒、常用操作面、移液器外壳等高频接触表面定期使用核酸/核酸酶清除剂进行去污染；

②制定并执行固定频次的表面清洁SOP。

（3）监测与追溯

①在关键节点设置阴性对照（如无模板对照），监控背景扩增与非特异降解；

②对出现异常的批次样品进行完整性和活性检测，结合操作记录追溯具体污染环节，并采取“源头替换+区域深度清洁+流程修订”的纠偏措施。

四、固相表面核酸/核酸酶清洁与环境治理

4.1固相污染的特征与风险

（1）污染形态

DNA/RNA往往以“吸附+干燥”的形式固着于塑料、玻璃和金属表面，简单水洗难以去除；干燥RNase在较长时间内仍可保持显著活性。

（2）风险表现

①干燥DNA（尤其是扩增产物）极易作为PCR/qPCR模板，导致假阳性；

②表面RNase一旦被带入反应体系，可快速降解RNA，造成难以解释的实验失败或定量偏差。

4.2表面清除剂的作用机理

（1）解吸与转移至液相

通过表面活性成分降低界面张力和破坏核酸/蛋白与固体界面的弱相互作用，将核酸及核酸酶从固相解吸至液相。

（2）化学降解与酶失活

配方中的活性组分可对核酸进行非酶降解或化学修饰（如糖–磷酸骨架断裂或碱基修饰），显著削弱其作为扩增模板的能力；同时破坏核酸酶蛋白的空间构象或关键侧链，使其失活。

（3）物理去除

经充分作用后，通过擦拭或冲洗将液相中的污染物从表面带走，实现核酸和核酸酶的实际清除。

4.3表面清除剂的选型逻辑

根据主要控制目标可将应用策略概括为三类：

（1）偏重核酸清除型

适用于：关注环境中游离DNA/RNA背景、但希望尽量减少对周围酶制剂活性的潜在影响的区域（例如扩增产物操作区附近设备表面）。

（2）偏重核酸酶清除型

适用于：RNA实验区域及常规核酸制备区域，主要目标是去除RNase/DNase污染，同时尽量避免对邻近核酸标准品和样本的强烈破坏。

（3）核酸+核酸酶双重清除型

适用于：极高灵敏度核酸检测平台或高风险交叉污染区域，需要同时显著降低固相核酸和核酸酶风险。此类产品通常对操作规范要求更高，使用后应注意充分擦拭/适度冲洗，并更换手套和耗材，避免清除剂残留带入反应体系。

五、工艺层面的组合策略：从单一手段到整体方案

5.1蛋白/病毒类产品中的去核酸组合流程

在蛋白质药物、抗体、病毒载体等生产流程中，较为稳健的核酸控制路径通常呈现“酶解预处理–吸附/沉淀–终抛光”的三级组合：

（1）前处理阶段

在细胞裂解或收获后加入核酸酶，优化Mg²⁺、温度和时间，使高分子核酸充分剪切以降低黏度。

（2）中段分离阶段

引入多聚阳离子沉淀或带正电吸附单元，进一步去除核酸及核酸–蛋白复合杂质，并通过在线监测（电导、pH、黏度）固化工艺窗口。

（3）末端抛光阶段

通过AEX、UF/DF等抛光单元，将残余核酸降至法规要求以下，并同步关注和去除可能残留的外源核酸酶。

5.2核酸类产品中的去核酸酶策略

对于质粒、mRNA、siRNA等核酸类产品，主要关注核酸酶污染控制，可概括为：

（1）预防原则

通过区域隔离、专用耗材、表面定期去污染，最大程度降低RNase/DNase的引入概率；

（2）过程监测

在关键用水、缓冲液和中间体节点开展核酸酶活性及核酸完整性检测，形成工艺内控闭环；

（3）终端控制

在配制和灌装等末端步骤严格控制环境与操作，必要时对工艺容器与输送系统进行专门的核酸酶清洁验证。

六、检测与放行：用可量化指标定义“清除水平”

6.1核酸残留的定量与表征

（1）qPCR/ddPCR

是宿主残留DNA定量的主流方法，qPCR通常通过特异性靶标设计与标准曲线实现定量；ddPCR基于分区与阳性计数进行绝对定量。需校正基质效应并采用适当内标。

（2）荧光染料法

利用dsDNA特异性染料进行快速定量，适用于过程监控，但受片段长度与基质干扰影响较大，不宜作为单一放行依据。

（3）电泳或片段分析

用于评估核酸是否已充分剪切及残留长链DNA的比例，为核酸酶处理效果提供结构维度的信息。

6.2核酸酶残留与背景活性的评估

（1）功能性活性检测

以标准DNA/RNA或荧光标记底物为探针，监测降解速率，是风险相关性最直接的指标，可用于评价RNase/DNase残留的工艺控制效果。

（2）特异蛋白检测

对已知外源核酸酶，可采用免疫学或靶向蛋白定量方法评估残留水平，与功能性测定结合可提高判读的可靠性。

七、常见失效模式与排查路径

（1）黏度持续偏高或过滤/层析严重受阻

①检查核酸酶添加条件（Mg²⁺、温度、时间、是否存在EDTA）；

②评估黏度来源是否主要为核酸，或是否存在多糖、细胞碎片等其他高黏度组分。

（2）目标核酸意外降解

①优先排查RNase污染：耗材、水源、台面、操作习惯；

②检查工艺核酸酶是否在UF/DF或层析前缺乏充分失活/去除步骤。

（3）去核酸措施导致产品收率异常下降

常见于多聚阳离子沉淀或AEX条件过“激进”，需通过pH–盐度二维优化实验和负载量扫描，明确核酸与目标分子之间的分离窗口。

（4）核酸或核酸酶检测结果批间差异大

多与取样点不一致、前处理方式差异或标准曲线体系变化相关，应通过标准化取样SOP、统一基质校准和方法学验证进行纠偏。

八、阿拉丁相关产品

         总体而言，核酸与核酸酶控制不应仅被视为“清洁”或“辅助”操作，而应被纳入工艺开发与实验平台构建的顶层设计之中：上游决定负荷，中游负责转化与分离，下游通过抛光与环境治理将残留风险压低到与用途相匹配的水平。只有在目标拆解清晰、手段组合有据、检测放行可量化的前提下，“核酸/核酸酶清除”才能从被动补救转变为主动设计，真正支撑高质量生物制品的连续生产和高可信度核酸检测体系的长期运行。