核酸电泳应用-制备电泳和分析电泳
核酸电泳应用-制备电泳和分析电泳
核酸电泳在分子生物学的许多研究应用中被用于检查实验结果，在某些情况下，在进行后续步骤之前，用于分离和纯化样本。因此，常规核酸电泳的应用大致可分为分析用和制备用，两者都依赖于分离、解析和定量技术。这些应用程序包括:
1. 分析电泳应用
a. PCR，限制性消化，连接，菌落筛选，逆转录，体外转录
b. 凝胶定量
c. 核酸纯化，样品碎裂，寡核苷酸合成效率
d. Southern印迹，Northern印迹，核酸酶保护测定
e. DNA构象，EMSA
2. 制备电泳应用
a. PCR，限制性消化，寡核苷酸合成，NGS大小选择
b. 凝胶纯化
i. 琼脂糖凝胶
ii. 聚丙烯酰胺凝胶
1. 确定实验结果的分析应用
核酸电泳的分析应用提供了在继续工作流程或另一组实验之前检查前一步实验结果的方法。该方法主要依赖于评估凝胶中所需条带的存在或不存在、它们的强度、迁移模式、迁移性和杂交，如下所述。
a. 测定酶合成、消化和克隆实验的成功程度
核酸电泳分析通常在以下技术（图10后立即进行，以确定实验的成功和效率:
l 聚合酶链式反应（PCR）可以在几小时内将目标序列的一个拷贝扩增到数百万个拷贝。在端点PCR后进行电泳，以确认目标物的扩增及其产量。
l 在限制性内切酶（与限制性内切酶发生反应，切割DNA底物上的特定序列）之后，样品在凝胶上运行，以确定DNA切割的模式（以及消化完成的程度）。
l 在分子克隆中，DNA片段通过一种叫做连接的过程被插入载体。在某些情况下，可以在结扎后进行电泳，以评估反应效率（图2）。然后用结扎产物转化克隆生物（如大肠杆菌）的能力细胞进行繁殖，之后筛选形成的菌落，以确定它们是否携带所需插入物的载体。PCR和限制性内切，这两种方法都经常涉及电泳作为工作流程的一部分，是集落筛选中常用的技术。
l 逆转录是由一种叫做逆转录酶的酶合成的与RNA模板互补的DNA。cDNA合成和RNA模板去除后，产物可在变性凝胶上运行，以评估反应效率。当已知的RNA序列或长度被反向转录时，这种方法最有用。
l 体外转录是通过RNA聚合酶从DNA模板合成RNA的过程。除去DNA模板后，合成的RNA可以在变性凝胶上运行，以确定是否成功。
图1。常见的分子生物学应用，其中电泳可用于确定实验的成功。
b. 凝胶电泳定量核酸样品
电泳可用于定量DNA或RNA条带利用标准或阶梯含有已知数量的每个片段。广泛使用的分光光度定量方法可能会因污染物（如核苷酸、引物和其他物种）的存在而产生偏差。电泳将感兴趣的样品从这些污染物中分离出来，提供了另一种可靠的定量策略。
凝胶定量是通过比较样品中条带的强度与梯子中条带的大小相似来估计样品的数量（图3A）。理想情况下，当使用用于定量的梯子时，应该加载不同数量的梯子，以绘制数量与强度的标准曲线，以便更精确地定量（图3B）。此外，用灵敏度高、动态范围宽的荧光染料对核酸进行染色，可以进一步提高凝胶定量。一些凝胶成像仪配备了分析软件，以便对凝胶中的样品进行更简单的定量，而另一些有云连接，用于数据存储。
c. 样品纯度、完整性、破碎度和合成效率的分析
凝胶电泳可用于评估核酸样品从来源提取后的纯度和完整性，以及样品破碎成功与否和合成后全长寡核苷酸的百分比。
l 基因组DNA污染RNA样本，反之亦然，可以用凝胶电泳检测样本纯度（图4A）。对污染物种的检测将取决于所使用的核酸染色剂的敏感性，以及污染物的数量。
l 使用凝胶电泳，可以通过评估28S和18S rrna的相对强度来检查提取后总RNA的完整性，以2:1的比例表示完整的RNA。涂片的存在，特别是在低分子量的情况下，表明RNA降解（图4B）。
l 有些方案要求对核酸样本进行碎片化处理，例如在染色质免疫沉淀（ChIP）和下一代测序（NGS）的样品输入准备中，以获得适合下一步的片段大小。样品的破碎效率可以通过凝胶电泳来检测（图4C）。
l 在合成之后，由于合成的耦合效率为100%，寡核苷酸产物将包含全长和截断或失效序列（即n-1, n-2，等）。电泳是根据不同长度寡核苷酸的大小和构象来区分全长产物和失效序列的一种方法。
图4。凝胶电泳测定样品纯度、完整性和碎片性。(A)提取的基因组DNA和总RNA在单独的凝胶上进行分析。红色箭头分别表示受污染的RNA和基因组DNA。污染的RNA只在电泳开始时检测到（≤5分钟运行）。(B)两个纯化的RNA样品通过电泳和28S和18S rrna分析来评估其完整性。(C)在凝胶上测定DNA碎片的效率和碎片DNA的分布。（M =分子量标准。RNA样品在变性凝胶上运行。）
d. 对混合样品中感兴趣的序列的检测
凝胶电泳是探针杂交检测核酸池中目标序列的关键工作流程（图5,6）。探针是已知序列的单链核酸，通过碱基互补性专门与目标序列结合。
在DNA片段分析中，Southern blot和限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析是两种众所周知的技术，在检测目标之前，使用电泳分离样品（图5）。
对于RNA片段分析，northern blots和核酸酶保护分析（NPA）也依赖于探针杂交来检测感兴趣的序列。北方印迹与南方印迹遵循相同的工作流程，除了输入是RNA（图5）。在核糖核酸酶保护试验（RPA）中，RNA探针与样品混合物中的目标序列结合。剩下的单链rna，如未结合的探针和模板，以及它们的悬垂物，然后被核糖核酸酶如RNase A/T1混合酶消化。然后，结合的探针和样品在凝胶上运行，用于下游目标的检测和分析。
e. DNA构象和核酸-蛋白质复合体的评价
正如电泳考虑部分所讨论的，相同序列的质粒DNA可能显示不同的电泳迁移率，这取决于构象。这一特性可用于评估DNA构象，以及提取后完整质粒的水平。
图7。电泳迁移率迁移试验。
2. 制备电泳纯化核酸样品
在核酸凝胶电泳的制备应用中，分离出的核酸经电泳分析后从凝胶基质中纯化。因此，用于凝胶纯化的电泳通常是下游应用的准备步骤。从逻辑上讲，凝胶制备策略可以与分析方法结合使用。
a. 涉及制备电泳的应用
制备电泳遵循许多分子生物学技术和应用，最常见的有：PCR；限制消化；寡核苷酸的合成；以及下一代测序（NGS）的片段化、端修改和连接步骤。
l PCR产物和限制性内切酶消化的DNA可以从凝胶中纯化，用于下游应用，如末端修饰、结扎、克隆和测序。
l 继寡核苷酸合成之后，聚丙烯酰胺凝胶电泳是从盐和截断序列中分离和纯化全长寡核苷酸的主要方法之一。
l 输入样本被碎片化，端修改，并连接到适配器，作为测序库准备的一部分。按照这些步骤，在特定大小范围内的DNA片段（例如200-300 bp）将在一个称为大小选择的过程中进行纯化，以除去低分子量和高分子量的片段，以及前面步骤中的适配器、酶和试剂。大小选择还有助于确保样本输入包含长度一致的片段，以实现高质量和一致的[1]测序。凝胶电泳是一种大小选择的方法，因为它可以有效地在较窄的范围内选择特定大小的碎片（图8）。
图8。尺寸选择前后的碎片尺寸分布。
b. 凝胶纯化概述
制备电泳是从凝胶中分离纯化核酸的关键步骤。核酸的纯化通常包括从凝胶基质中切除所需的样品带，然后提取核酸。在进行凝胶纯化时，应注意:
l 尽量减少凝胶材料的切除量，以方便提取
l 防止凝胶可视化过程中核酸的损伤
如果使用UV可激发染料（如溴化乙锭）进行显示，尽量减少样品暴露在辐射下，使用较长的UV波长进行激发（如360 nm而不是254 nm），并选择外光而不是透光。能被低能量蓝光激发的荧光染料是样品可视化的较好选择，因为它们减少了样品因辐射造成的损伤。
由于琼脂糖和聚丙烯酰胺不同，两种凝胶基质的纯化策略通常不同，总结如下:
i. 琼脂糖凝胶的纯化
在切除带有所需带的凝胶基质后，琼脂糖可通过加热熔化。在1%的凝胶浓度下，标准琼脂糖在90°C和低熔点（LMP）琼脂糖在65°C熔化。LMP琼脂糖由于熔点较低，可以提高提取核酸的完整性和得率。对于比加热更温和的方法，可以考虑使用琼脂糖酶，将琼脂糖链分解为低聚糖。琼脂酶消化需要使用LMP琼脂糖，使琼脂酶在LMP琼脂糖的低胶凝温度下保持活性。
琼脂糖融化或消化后，核酸可按以下几种方法之一提取[2]。苯酚萃取-乙醇沉淀是一种简单有效的核酸纯化方法。由于苯酚的毒性以及将其作为有机废物处理的要求，目前流行的一种方法是将核酸与硅基色谱柱结合，在有朝色剂存在的情况下将其从色谱柱中洗脱，从而分离核酸（图9）。
图9。用硅基柱从凝胶基质中提取DNA。
另一种非常简单和快速的分离特定条带的方法是使用带有两排孔[3]的特殊琼脂糖凝胶。样品装入顶部行，随着电泳过程的进行，从底部行检索所需大小的条带。
ii. 聚丙烯酰胺凝胶的纯化
由于聚丙烯酰胺凝胶是由聚合反应形成的，不能简单地通过加热去除凝胶基质。核酸通常通过“粉碎和浸泡”或电洗脱的方法从聚丙烯酰胺凝胶中提取（图10）。
l 在粉碎和浸泡法中，通过注射器或使用小杵将切除的凝胶带压碎。冷冻凝胶片可以使它更容易碾碎。将压碎的凝胶浸泡在洗脱缓冲液中18-36小时，轻轻摇晃。然后将洗脱的核酸用乙醇沉淀进行浓缩和纯化。
l 电洗脱法使用电场将核酸从凝胶基质中移出。一种简单的方法是将切除的带置于具有小分子量截止的透析膜内。然后，将包含凝胶片的透析膜进行电泳，以从凝胶中洗脱核酸。
综上所述，核酸凝胶电泳在广泛的分子生物学工作流程和技术中具有广泛的应用。尽管电泳的基本方法自20世纪70年代以来基本没有改变，但它已被证明是分离和分析核酸的强大技术，应用范围从限制性消化到下一代测序。
参考文献:
1.Head SR, Komori HK, LaMere SA et al.(2014) Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques, 56(2):61–4, 66, 68.
2.Moore D, Dowhan, D, Chory J et al.(2002) Isolation and Purification of Large DNA Restriction Fragments from Agarose Gels.In: Ausubel FM et al.(editors) Current Protocols in Molecular Biology.Supplementary 59: Unit 2.6.
3.Gibson JF, Kelso S, Skevington JH (2010) Band-cutting no more: A method for the isolation and purification of target PCR bands from multiplex PCR products using new technology.Mol Phylogenet Evol, 56:1126–1128.
4.Chory J, Pllard JD (1999) Resolution and Recovery of Small DNA Fragments.In: Ausubel FM et al.(editors) Current Protocols in Molecular Biology.Supplementary 45: Unit 2.7.
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