在大肠杆菌等原核宿主中进行重组蛋白表达时，包涵体（inclusion bodies）的形成是常见现象之一。对于许多难溶或具有复杂结构的蛋白，尤其是含有大量二硫键或无序区域的人源蛋白，包涵体往往几乎不可避免。表面上看，包涵体代表着错误折叠与不溶性，但在适当的策略下，包涵体既可以作为一种“保护形态”，也可以成为粗纯化的有利起点。通过合理地溶解与复性，仍然有机会获得高纯度且具有生物活性的目标蛋白。

一、包涵体的形成与特征

包涵体是重组蛋白在高水平表达时形成的不溶性蛋白聚集体，在大肠杆菌中尤为常见。相较于真核细胞，细菌胞质环境具有较强的还原性，这一特性影响蛋白质折叠与二硫键形成。当外源蛋白表达水平高于细菌内源蛋白总量的一定比例时，折叠负荷增加，错误折叠和聚集显著增强，从而促进包涵体形成。

包涵体通常具有以下特征：

1）以高密度颗粒形式存在于细胞内，离心后集中于沉淀部分；

2）由高浓度的错误折叠或部分折叠蛋白组成，常伴随分子间二硫键交联；

3）在显微镜下常见于细菌极端位置，呈高密度颗粒状分布。

尽管包涵体代表蛋白折叠失败，但其高度富集、成分相对单一的特点，也为后续的粗纯化和保护蛋白稳定性提供了基础。

二、包涵体对宿主毒性的缓冲作用

不少重组蛋白对宿主细胞具有潜在毒性。例如人源转录因子在细菌中高表达时，可能通过非特异性结合细菌基因组DNA，扰乱原本精细调控的转录网络，抑制细胞生长甚至导致死亡。此时，高表达细胞往往在培养过程中迅速失活，只剩下低表达细胞持续增殖，从而显著降低可获得的目标蛋白总量。

将此类蛋白强制表达至包涵体，有可能减轻这类毒性效应。包涵体对蛋白进行物理隔离，使其难以接触DNA或其他关键细胞组分，从而避免干扰宿主正常生理活动。在实际操作中，通过减少培养早期的“漏表达”、在细胞密度合适时快速诱导，并提升表达强度将蛋白推入包涵体，可以在不明显抑制细菌增殖的前提下，获得更高的蛋白总产量。

三、包涵体对蛋白水解降解的抑制作用

对结构高度无序或含长无序区段的蛋白来说，蛋白酶介导的降解尤为突出。即使在裂解和纯化过程中加入蛋白酶抑制剂，也难以完全阻止蛋白在表达阶段就被细菌内源蛋白酶剪切。结果往往是：

1）产物中既有全长目标蛋白，也有大量截短片段；

2）降解片段与全长蛋白物理化学性质相近，分离困难；

3）纯度与产量均受到限制。

当蛋白以包涵体形式存在时，蛋白质被紧密聚集在不溶颗粒内部，空间上与多数可溶性蛋白酶隔绝。只要在裂解后通过多轮洗涤去除上清中的蛋白酶，再进行包涵体溶解，就可以在几乎无蛋白酶背景的条件下获得目标蛋白，从而明显降低表达过程中产生的降解问题。

四、从包涵体中溶解并纯化蛋白

1.包涵体作为“粗纯化”步骤

细胞裂解后，通过离心即可将包涵体集中到沉淀中，而大部分内源可溶性蛋白（包括蛋白酶）保留在上清。随后用裂解缓冲液多次重悬和离心包涵体沉淀，可以有效洗去可溶性杂蛋白。这一过程实质上就是利用包涵体作为初步分离步骤，为后续溶解与纯化创造更简洁的起点。

2.包涵体溶解：强变性剂与还原剂

从包涵体中释放蛋白，通常依赖强变性剂和还原剂的联合作用。

常用方案包括：

6–8 M尿素或6 M盐酸胍（guanidine hydrochloride），并辅以DTT或TCEP等还原剂以断裂分子间、分子内二硫键。

操作步骤通常为：

1）将洗涤后的包涵体沉淀用含有尿素或盐酸胍及还原剂的缓冲液重悬；

2）通过超声、搅拌或反复吹打充分分散沉淀；

3）室温或低温孵育30–60分钟，使变性剂与还原剂充分作用；

4）再次离心，将不溶物分离，此时目标蛋白主要位于上清中。

若目标蛋白带有His标签，可在高尿素或高盐酸胍条件下直接进行Ni²⁺亲和层析，实现进一步纯化。该步骤利用包涵体本身的富集优势，有助于快速获得高浓度的目标蛋白。

五、蛋白复性：从变性状态回到天然构象

使用尿素或盐酸胍溶解包涵体的同时，不可避免地使蛋白完全或高度变性，失去原有二级与三级结构。因此，如何在避免聚集的前提下去除变性剂并恢复蛋白天然折叠，是整个流程中最具挑战性的环节之一。

1.透析复性

透析是最常见、最直观的复性方法之一。具体做法是将含有变性蛋白的溶液装入透析袋，在含低浓度或不含变性剂的缓冲液中缓慢透析，使尿素或盐酸胍逐步扩散出去。

其优点是操作简便、条件可控；但也存在两大潜在问题：复性过程缓慢，蛋白在部分折叠的中间态停留时间较长；这些中间态往往表面疏水性暴露严重，极易彼此结合形成聚集体，导致可溶蛋白得率下降。通过优化透析速率、蛋白浓度、盐浓度、pH以及添加伴侣蛋白或小分子助折剂，可以在一定程度上提高成功率，但对许多易聚集蛋白仍具有较大不确定性。

2.在柱上复性对于带有His标签的蛋白，在Ni²⁺亲和层析柱上进行复性是一种常见且有效的策略。大致流程如下：

1）在含高浓度尿素或盐酸胍的结合缓冲液中，将变性蛋白上样至Ni²⁺柱，使其通过His标签与树脂结合；

2）保持蛋白结合于树脂上，逐步或直接将流动相更换为不含变性剂的缓冲液；

3）在此过程中，蛋白在固定状态下快速脱离变性剂并完成折叠；

4）完成复性后，再用含咪唑的洗脱缓冲液将蛋白洗脱下来。

这种方法的优势包括：复性过程时间短，可在数秒至数分钟内完成，减少中间态聚集的机会；蛋白被固定于树脂上，空间自由度受限，不易彼此接触聚集；复性与纯化在同一载体上完成，流程相对紧凑。

六、复性蛋白的功能验证

即使在生化和生物物理参数上看似合理，复性蛋白是否真正恢复了功能，仍需通过下游功能实验加以确认。常见的验证方式依据蛋白类型而定，包括但不限于：

1）酶学活性测定；

2）受体–配体结合实验；

3）DNA或RNA结合实验；

4）细胞水平的功能恢复或信号通路激活实验等。

以DNA结合型转录因子为例，可以采用电泳迁移率变动分析（EMSA）或定量结合实验，比较从包涵体复性获得的蛋白与从可溶表达直接纯化的蛋白对特定DNA序列的亲和力。若两者在相同条件下的结合曲线高度一致，则说明包涵体来源蛋白已恢复至正确的折叠状态和功能状态。

在更高分辨率层面，X射线晶体学或核磁共振（NMR）等结构研究手段亦可用于验证复性蛋白的三维结构是否与其他制备方式获得的蛋白一致。然而，对大多数常规应用而言，适当设计的功能实验已经足以判断复性是否成功，无需一定求助于结构学手段。

通过合理设计表达策略、选择合适的变性和溶解条件，并结合透析或在柱上复性等手段，许多原本不溶或易聚集的蛋白仍然可以被成功复性为可溶且具有生物活性的形式。尽管并非所有蛋白都适合通过包涵体路径制备，但在表达困难蛋白或强毒性蛋白时，将包涵体视为一种可利用的中间形态，而非单纯的副产物，有助于拓展实验设计思路，并提高获得高质量重组蛋白的可能性。

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