一、实验原理

油红O（Oil Red O）属于脂溶性偶氮染料，具有较强的疏水性，易溶于有机溶剂，而在水相中的溶解度较低。将组织切片或细胞暴露于油红O工作液时，染料优先溶解并富集于细胞内的中性脂质（如三酰甘油、胆固醇酯）中，形成橘红至红色的脂滴信号，而水相及多数亲水性组织成分几乎不保留染料，从而实现对脂质的相对选择性染色。

二、实验准备

1.材料准备

新鲜组织样本（如脂肪组织、肝脏组织等）、4%多聚甲醛固定液、60%异丙醇、油红O储备液（0.5 g油红O溶于100 mL异丙醇）、油红O工作液（使用前将油红O储备液与蒸馏水按3∶2混合，充分混匀后过滤备用）、苏木精染液、1%盐酸酒精分化液、伊红染液、中性树胶、载玻片、盖玻片、染色缸及光学显微镜等。

2.仪器设备

切片机、恒温箱、微量移液器、离心机、天平等常规组织学实验设备。

三、样本处理

1.固定

取适量新鲜组织，尽快置于4%多聚甲醛固定液中固定约4–24 h，以保证组织细胞形态和结构稳定。具体固定时间可根据组织块大小及组织类型适当调整。

2.脱水与包埋

固定结束后，将组织依次置于不同体积分数的乙醇溶液中（70%、80%、90%、95%、100%），每个浓度脱水约1–2 h。完全脱水后，置于二甲苯中透明，再浸入熔融石蜡中进行包埋，制成石蜡块。

四、切片与脱蜡

1.切片

使用切片机将石蜡包埋组织切成约4–6 μm厚的连续切片，展片后粘附于载玻片上，晾干备用。

2.脱蜡与水化

将载玻片依次置于二甲苯I、二甲苯II中各浸泡约10–15 min，充分去除石蜡。随后依次置于100%、95%、90%、80%、70%乙醇中各浸泡约5 min，完成梯度水化，最终用蒸馏水冲洗，备用。

五、油红O染色

1.油红O染色

将完全水化后的切片置于预先配制并过滤好的油红O工作液中，于37℃恒温孵育约10–20 min。染色时间可根据组织类型及脂质含量适当微调，一般在脂滴呈现均匀橘红色时为宜。

2.分化

染色结束后，用60%异丙醇快速分化数秒至十余秒，以去除多余背景染料，保留脂质特异性染色信号。随后用蒸馏水轻柔冲洗切片。

3.复染（细胞核）

将切片浸入苏木精染液中染色约3–5 min，对细胞核进行复染。染后用自来水或缓慢流动的自来水冲洗，使多余染料洗脱。

4.分化与返蓝

将切片短暂浸入1%盐酸酒精分化液中数秒，轻度分化细胞核染色，随后用自来水冲洗约10–15 min，使细胞核充分返蓝，呈清晰蓝色。

六、封片与显微观察

1.细胞质复染（可选）

如需进一步显示细胞质，可在返蓝后将切片浸入伊红染液中染色约1–2 min，使细胞质呈现淡红至粉红色。染色后用蒸馏水迅速冲洗，去除多余染液。

2.脱水与透明

根据实验设计，如需采用中性树胶封片，可再次将切片依次置于70%、80%、90%、95%、100%乙醇中各浸泡约3–5 min进行脱水，然后置于二甲苯I、二甲苯II中各浸泡约5–10 min进行透明。操作过程中注意避免切片干裂或卷曲。

3.封片

在透明后的切片上滴加适量中性树胶，小心盖上盖玻片，排除或尽量减少气泡。可在室温下自然晾干，也可置于烘箱中低温烘干，直至树胶完全固化。

4.显微观察与记录

封片干固后，将切片置于光学显微镜下观察，先用低倍镜查看组织整体结构及脂质分布，再切换至高倍镜观察脂滴大小、形态及染色强度。根据实验需求进行图像采集和结果记录。

七、常见问题问答

Q1：背景很脏、切片一片红，看不清脂滴怎么办？

背景偏重通常与以下因素有关：工作液未充分过滤；染色时间过长；60%异丙醇分化不足；切片在染色过程中干裂或产生沉淀。可通过加强过滤（建议每次使用前过滤）、缩短染色时间、适当延长分化时间、注意保持切片始终处于液体中防止干片，来降低背景。若仍有大量沉淀，可考虑更换新鲜配制的工作液。

Q2：石蜡切片和冰冻切片的结果可以直接比较吗？

从方法学角度看，两者脂质保留程度和处理步骤有明显差异。石蜡切片在脱水和透明过程中不可避免地会抽提部分脂质，信号往往偏弱，适合定性或半定性观察；冰冻切片对脂质保存更好，更适用于对脂滴含量变化的对比和定量分析。因此，如需严格比较不同处理组之间的脂滴差异，建议采用同一种切片方式并统一前处理条件，不建议直接将石蜡切片结果与冰冻切片结果混合比较。

Q3：固定时间需要非常精确吗？固定过长会有什么影响？

固定时间并不需要精确到分钟，但应控制在合理区间。4–24 h是常用范围，时间过短可能导致组织结构不稳定、切片质量差；时间过长则可能导致交联过度，使染料渗透困难，脂滴形态和分布受到影响。对于体积较小的组织或薄片，可以适当缩短固定时间，对体积较大或质地较硬的组织，可适当延长，但不建议长期浸泡数日。

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