本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3’端

材料与仪器

限制性内切核酸酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 模板 DNA
乙酸铵 乙醇 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L )

乙醇

2. 酶和缓冲液

适宜的限制性内切核酸酶

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

3. 核酸和寡核苷酸

含适当未标记的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液

模板 DNA ( 0.1~5 μg )

4. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性为 800~3000 Ci/mmol）

5. 专用设备

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

预先设定至 75℃ 的水浴

二、方法

1. 在 25~50 μl 的适当的限制酶缓冲液内，用所需限制酶消化高达 5 μg 模板 DNA。

2. 向完成的限制酶消化反应中，加入：

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP        
（比活性 800~3000 Ci/mmol）     2~50 μCi
未标记的 dNTP                           至终浓度为 100 μmol/L
Klenow 片段                               1~5 单位

室温温育反应 15 min。

3. 于 75℃ 加热 10 min 以终止反应。

4. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 DNA 与未掺入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸铵存在下进行两轮乙醇沉淀。

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