一、目的与原理

1.1适用范围

本操作规程适用于：

（1）石蜡组织切片、冰冻切片中多糖类物质（糖原、中性黏多糖、糖蛋白、基底膜等）的显示；

（2）血片及骨髓涂片中胞浆糖原、糖蛋白颗粒等的半定量观察；

（3）肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液、真菌及阿米巴滋养体等PAS阳性结构的显示。

1.2染色原理

（1）过碘酸（HIO₄）可将多糖分子中相邻两个碳上的乙二醇基氧化生成醛基（–CHO）；

（2）生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红衍生物发生缩合反应，恢复品红色发色团，呈现紫红～红色沉着；

（3）经苏木精复染细胞核后，可形成“PAS阳性结构红色/紫红色、细胞核蓝色”的对比，便于判读。

二、试剂与材料

2.1标本与固定

（1）组织标本

①固定：常用10%中性缓冲甲醛固定；如以糖原显示为主，可采用Carnoy固定液：

无水乙醇60mL

冰醋酸10mL

氯仿30mL

②石蜡包埋、切片（一般厚度3–5μm）。

（2）血片/骨髓片

①新鲜涂片，空气干燥；

②无水甲醇固定5–10min。

2.2主要试剂

（1）过碘酸工作液

用于组织切片：

①0.5%～1.0%过碘酸水溶液；

②使用前新鲜配制或短期（2周内）于2–8℃避光保存。

参考配方（组织用酒精型）：

过碘酸（HIO₄·2H₂O）0.4g

95%乙醇35mL

0.2mol/L醋酸钠溶液5mL

蒸馏水10mL

（2）Schiff试剂（Schiff氏液）

基本配方示例：

①碱性品红0.5g溶于100mL蒸馏水中，加热至微沸并振荡，完全溶解；

②冷却至约50℃，过滤后加入1mol/L盐酸10–20mL，混匀；

③待溶液冷却至25℃，加入偏重亚硫酸钠/焦亚硫酸钠0.5–1.0g，充分混匀；

④置棕色瓶，室温避光至少24h，使溶液完全褪色至近无色；

⑤如仍带明显红色，可加入1–2g活性炭吸附，过滤备用；

⑥2–8℃、避光保存，溶液变为红色时不得再用。

（3）苏木精染液

可选Harris或Mayer苏木精，也可用下列配方：

①苏木素0.9g溶于95%乙醇10mL；

②明矾（铵明矾或钾明矾）20g溶于蒸馏水200mL（可加热助溶）；

③将苏木素酒精液缓慢加入明矾液，混匀，加热煮沸；

④加入氧化汞0.5g，迅速搅拌，溶液转为深紫色，立即移入冷水冷却；

⑤放置过夜过滤，使用前取95mL染液加入冰醋酸5mL；

⑥室温避光保存。

（4）亚硫酸洗液（可选，用于组织PAS染色后消除背景）

①1%偏重亚硫酸钠10mL

②1mol/L盐酸10mL

③蒸馏水180mL

（5）其他常规试剂

①二甲苯（脱蜡、透明）；

②梯度乙醇（100%、95%、80%、70%等）；

③自来水/蒸馏水；

④中性树胶封片剂。

2.3主要器材

（1）石蜡切片机、浮片台、烤片箱；

（2）显微镜；

（3）恒温箱（可选）；

（4）染色缸、载玻片、盖玻片等。

三、操作步骤

3.1组织石蜡切片PAS染色

（1）脱蜡至水

①石蜡切片60℃烤片30–60min；

②二甲苯2次，各10min；

③100%乙醇2次，各5min；

④95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2–3min；

⑤自来水冲洗入水。

（2）氧化（过碘酸处理）

①将切片置于0.5%–1.0%过碘酸溶液中作用5–10min（常用10min）；

②取出后自来水充分冲洗5–10min，以除去残留氧化剂。

（3）Schiff试剂染色

①切片置入Schiff试剂中孵育10–20min（常用10–15min）；

②取出后流水冲洗5–10min，直至切片背景由浑浊逐渐变为清晰、略带浅粉；

③如背景较深，可增加流水时间，或在亚硫酸洗液中短暂处理后再流水冲洗。

（4）苏木精复染细胞核

①切片置于苏木精染液中2–5min（依据染液强度适当调整）；

②自来水冲洗5min；

③如核染过深，可用1%盐酸酒精快速分化数秒，再自来水“蓝化”数分钟。

（5）脱水、透明、封片

①70%–95%–100%乙醇梯度脱水，每级1–2min；

②二甲苯透明2次，各5min；

③滴加中性树胶封片剂，覆盖盖玻片，避气泡。

3.2血片/骨髓涂片PAS染色

（1）固定

①新鲜血片或骨髓片空气干燥；

②无水甲醇固定5–10min，晾干。

（2）氧化

①置于10g/L（1%）过碘酸水溶液中作用20min；

②蒸馏水洗涤数次，轻轻甩干或自然晾干。

（3）Schiff试剂染色

①片面覆盖Schiff试剂或置于染缸中孵育45–60min（常用60min）；

②自来水细水长流冲洗10–15min，去除游离染料，背景变浅。

（4）苏木精染色

①置于苏木精染液5–10min；

②自来水冲洗10–15min，晾干。

（5）可直接在油镜下观察，或按需要封片。

四、结果判读

4.1组织切片

（1）PAS阳性结构

①肾小球基底膜、血管基底膜：呈均匀红色或紫红色增厚带；

②结肠杯状细胞、黏液腺分泌物：中性黏液呈红色；

③肝细胞、骨骼肌等内糖原：胞浆颗粒或弥漫红色；

④真菌菌丝、孢子、阿米巴滋养体细胞壁：呈明显红色。

（2）细胞核

经苏木精复染后呈蓝色或蓝紫色。

4.2血片/骨髓片

（1）阳性反应

①血小板：胞浆呈深红色；

②中性粒细胞：胞浆呈红色或深红色，可见PAS阳性颗粒；

③单核细胞：胞浆淡红色，可伴细小或粗大阳性颗粒；

④部分淋巴细胞：胞浆可见少量淡红或红色颗粒；

⑤巨核细胞：胞浆呈弥漫红色或深红色。

（2）阴性或弱阳性

①正常红细胞、骨髓有核红系前体：一般不染或阴性；

②某些未分化细胞PAS表现与病理类型有关，可结合形态与其他染色综合分析。

五、质量控制与注意事项

5.1质控要点

（1）每批染色建议同时放置已知PAS阳性组织（如肾、结肠）作为对照；

（2）检查过碘酸与Schiff试剂有效性：

①过碘酸溶液需透明无沉淀，超过建议保存期应更换；

②Schiff试剂应为无色或极浅色，若明显转红则表示已氧化失效；

（3）流水冲洗时间不足易导致背景染色过深；时间过长一般不影响阳性结构但影响对比度。

5.2常见问题与排查

（1）整体染色过浅

①过碘酸浓度过低或作用时间不足；

②Schiff试剂失效或孵育时间不足；

③需核实试剂配制和保存条件。

（2）背景过深或非特异染色

①流水冲洗时间不足或亚硫酸洗涤不充分；

②组织固定不当或切片过厚；

③可适当延长流水时间或优化固定条件。

（3）血片细胞形态不清

①固定时间不当或干燥不充分；

②染色时间过长导致核与胞浆界限不清；

③可调整固定时间和苏木精染色时间。

六、安全与废物处理

（1）过碘酸具有氧化性，配置与操作时应佩戴防护手套、护目镜，避免与有机可燃物直接接触；

（2）Schiff试剂中涉及酸和偏重亚硫酸盐，注意通风，防止吸入刺激性蒸气；

（3）含有机染料和重金属（如氧化汞）的废液需按化学危险废物集中收集处理，不得直接排入下水系统；

（4）操作全程遵守实验室生物安全与化学品管理规范。

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