简介
        氨基氧基 PEG 链接剂可通过醛基与氨基氧基反应生成醛肟而用于生物连接。它比腙和亚胺稳定得多。在大多数情况下，它无需还原就可直接使用，而肼键和亚胺键通常需要还原才能形成稳定的 C-N 键。

        在不含胺的中性条件下（pH 值为 6.5-7.5），烷氧基胺与羰基的反应最为有效。羰基可能存在于多糖的还原端。要产生额外的羰基，可使用特定的氧化酶（如半乳糖氧化酶）或 1-10mM 的偏高碘酸钠氧化糖基，或使用 Ald-PEG-NHS 酯引入醛基。在酸性条件下（如 0.1M 乙酸钠，pH 值为 5.5）使用高碘酸盐进行氧化最有效，不过也可使用中性缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水。如果在酸性条件下进行氧化，可能需要通过透析或凝胶过滤将缓冲液交换到中性缓冲液中，以获得最佳的烷氧基胺反应。有时，苯胺可用于加快酰肼和烷氧基胺分子与活性醛/酮（羰基）的偶联速率。

图 1：肟键的形成是一种特殊的生物正交反应，使用合适的催化剂可大大加快反应速度。

        a. 氨基氧化合物与醛反应生成醛肟的方案。
        b. 亚胺、腙和肟的稳定性比较。
        c. 加速肟键形成的常用催化剂。
        d. 最近发现的用于肟键形成的低毒催化剂。

使用烷氧基胺生物素试剂标记糖蛋白的示例方案
        注：最佳烷氧基胺-生物素浓度和反应条件取决于特定蛋白质和下游应用。为获得最佳效果，请根据经验优化试剂和糖蛋白的摩尔比。

A. 所需材料
        • 烷氧基胺-生物素溶液： 50mM 烷氧基胺-生物素试剂（DMSO）。准备足够的体积，以达到步骤 B.3 中所需的最终浓度。
注意：烷氧基胺生物素试剂是吸湿性固体，难以称量和分装。为便于操作，可将小瓶中的全部试剂（50 毫克）溶于干燥（无水、分子筛处理过）的有机溶剂（如二甲基亚砜）中，制成 250 毫摩尔的储备溶液。将储备溶液保存在 -20°C 下，最长可保存 1 个月；打开前将小瓶加热至室温，以防湿气凝结。
        • 氧化缓冲液： 0.1M 乙酸钠，pH 5.5
        • 在氧化缓冲液中加入 20mM 的偏碘酸钠： 使用前立即在琥珀色小瓶或其他避光容器中配制溶液。
        • 耦合缓冲液： 0.1M 磷酸钠、0.15M 氯化钠；pH 7.2（PBS）或其他中性或微碱性、非胺缓冲液 
        • 氧化缓冲液中 2 毫克/毫升的糖蛋白
        • 透析盒或脱盐柱

B. 程序
        1. 将 1mL 冷的偏碘酸钠溶液加入 1mL 冷的糖蛋白溶液中，混匀。将混合物在冰上或 4°C 避光处孵育 30 分钟。注：若仅氧化硅烷酸基团，可加入 50μL 而非 1mL 的元过碘酸钠溶液，这样过碘酸最终浓度为 1mM（而非 10mM）。
        2. 去除多余的偏高碘酸钠，并通过与偶联缓冲液透析或用偶联缓冲液平衡的脱盐柱交换缓冲液。
        3. 在缓冲液交换后的 9 份氧化蛋白中加入 1 份烷氧基胺生物素溶液（得到 5mM 烷氧基胺生物素）。室温下搅拌反应 2 小时。
        4. 通过透析或脱盐将生物素化蛋白质与未反应物质分离。使用与非生物素化样品相同的条件储存生物素化蛋白质。

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