一、目的与适用范围

       利用聚乙二醇（PEG）与透析袋配合，通过渗透压差实现蛋白质溶液的温和浓缩。适用于体积为几十至数百mL、对剪切力敏感且需在低温条件下处理的蛋白样品。

二、实验原理

       将装有蛋白质溶液的透析袋置于高浓度PEG粉末或PEG溶液中。PEG作为强吸水剂，通过半透膜建立渗透压差，将水和小分子从袋内“抽出”，而蛋白质等大分子被截留在透析袋内，从而降低样品体积，提高蛋白质浓度。

优点：条件温和，对蛋白构象和活性影响较小；不需要专用超滤设备，成本低；适用于小体积样品。

缺点：浓缩速度较慢，常需数小时甚至过夜；如事先不处理盐分，浓缩过程中盐浓度可能升高；透析袋封装和转移过程中存在少量样品损失风险。

三、材料与试剂

1）透析袋：截留分子量（MWCO）一般选择为目标蛋白分子量的约1/3–1/2，例如浓缩50 kDa蛋白，可选用MWCO 10–15 kDa的透析袋。

2）聚乙二醇（PEG）：相对分子质量需大于透析袋MWCO，一般选择为MWCO的≥2倍，常用PEG 20 000或PEG 35 000，其中PEG 20 000应用最广。

3）透析袋夹子或耐拉伸线绳。

4）烧杯、培养皿、托盘等容器。

5）超纯水及配套缓冲液。

6）4°C冰箱（需要低温时使用）。

四、操作步骤

1.透析袋预处理

1）戴手套，剪取长度合适的透析袋，预留两端封口空间。

2）将透析袋置于盛有大量超纯水的烧杯中，浸泡冲洗片刻，除去表面保存液。

3）如透析袋为干膜或含甘油保存型，可先置于大体积0.1 M EDTA溶液中煮沸10 min，以去除生产过程中残留杂质，再用大量超纯水彻底冲洗内外表面。

4）预处理后的透析袋可暂时浸泡在超纯水或后续使用的缓冲液中，待用。

2.上样与封口

1）先用透析袋夹子或线绳封紧透析袋一端，封口需紧密可靠。

2）加入适量超纯水，轻压检查是否存在渗漏，如有渗漏应重新封口或更换透析袋。

3）将蛋白质溶液用移液器缓慢、沿壁加入透析袋，避免产生大量气泡。

4）排除袋内上方空气后，用夹子或线绳封紧另一端，确保两端均密封良好。

3.PEG浓缩

方法一：PEG粉末法（常用，速度较快）

1）在干燥培养皿或烧杯底部铺设约1–2 cm厚度的PEG粉末。

2）将封好的透析袋平放其上，尽量展开，使受PEG作用的表面积最大化。

3）在透析袋上方及周围覆盖足量PEG粉末，使其基本被PEG完全包裹。

4）将装置置于4°C冰箱中进行浓缩，以抑制微生物生长并提高蛋白稳定性。

方法二：PEG溶液法（较温和，速度可控）

1）配制高浓度PEG溶液（如50% w/v PEG 20 000）。

2）将封好的透析袋置于装有该PEG溶液的烧杯中，确保透析袋完全浸没。

3）将烧杯置于4°C冰箱中，进行缓慢浓缩。

4.浓缩过程监测与控制

1）每隔约30–60 min取出观察透析袋，评估体积变化及收缩程度（可通过称重或目测估算）。

2）正常情况下可观察到透析袋因失水逐渐变软、体积减小。

3）在不破坏封口的前提下，轻轻晃动或柔和揉捏透析袋，使袋内溶液重新分布，避免局部蛋白浓度过高引起沉淀。

4）当透析袋体积接近目标体积时立即终止浓缩，防止过度浓缩导致蛋白聚集或沉淀。

5.终止浓缩与样品回收

1）从PEG粉末或PEG溶液中取出透析袋。

2）用大量超纯水或缓冲液彻底冲洗透析袋外壁，去除附着PEG，避免污染样品。

3）可将透析袋短暂浸入干净缓冲液中，再用纸巾轻轻擦干外壁。

4）打开透析袋一端，用移液器小心吸取浓缩后的蛋白质溶液，转移至洁净离心管中。

5）如有需要，可用少量同一缓冲液冲洗透析袋内壁，回收残留蛋白并合并至主样品中。

五、注意事项与优化建议

1.全程低温操作：尽可能在4°C条件下进行透析袋预处理、浓缩和样品转移，以提高蛋白结构与活性的稳定性。

2.避免过度浓缩：过度去除水分容易导致蛋白不可逆聚集和沉淀，应在接近目标体积时缩短检查间隔，必要时宁可略低于目标浓度。

3.盐浓度控制：PEG浓缩会同时保留小分子盐，若初始盐浓度较高，浓缩后盐浓度将进一步升高，建议在浓缩前先用低盐缓冲液透析置换，以减轻盐效应。

4.防止PEG污染：务必彻底清洗透析袋外壁，避免PEG进入样品，因其可干扰后续蛋白定量、酶活检测及色谱分析。

5.效率影响因素：浓缩速率与PEG种类和用量、温度、透析袋MWCO以及有效接触面积相关。PEG粉末法效率较高但更易过浓，PEG溶液法速度较慢且可控性较好，可根据样品敏感性与时间要求合理选择。

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