实验方案（Protocols）

PIK-III 抑制剂实验方案：制备与检测指南

· · 发布于 2026年10月10日 · 更新于 2026年10月10日 ·

PIK-III是一种选择性、细胞可渗透的VPS34（III类PI3K）抑制剂，广泛用于自噬和内体转运研究，以解析磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）信号通路。

靶点: VPS34（III类磷脂酰肌醇3-激酶）
主要应用: 在细胞及生化实验中抑制自噬和PI3P生成
推荐溶剂: DMSO（用于储备液配制）
货号: P413812
Selleck参考编号: S7683
储存条件: 于-20°C避光干燥保存；分装以避免反复冻融

PIK-III概述及作用机制

PIK-III（货号：P413812；Selleck S7683）是一种强效、选择性小分子抑制剂，靶向VPS34——哺乳动物细胞中唯一的III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。VPS34催化磷脂酰肌醇的磷酸化，生成磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P），这是一种关键的脂质第二信使，参与调控自噬体成核、内体分选和溶酶体生物发生。

通过选择性阻断VPS34激酶活性，PIK-III抑制早期内体和吞噬泡组装位点的PI3P生成，有效阻断早期自噬并干扰内体转运。其对VPS34相较于I类和II类PI3K亚型的高度选择性，使其成为解析VPS34特异性信号通路的首选药理学工具，避免了万曼霉素（wortmannin）或LY294002等泛PI3K抑制剂带来的脱靶效应干扰。

储备液配制

推荐溶剂：将PIK-III溶于无菌无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制高浓度储备液。由于PIK-III水溶性有限，DMSO为首选溶剂。

计算所需质量：确定所需储备液体积及目标浓度（DMSO储备液通常为10–50 mM）。
称量化合物：使用分析天平在洁净干燥的微量离心管中精确称量适量PIK-III粉末。
加入DMSO：将计算所得体积的无水DMSO直接移液至含PIK-III粉末的管中。
充分溶解：剧烈涡旋30–60秒，必要时在水浴超声仪中超声5–10分钟，直至获得澄清溶液。若仍有颗粒残留，请勿继续操作。
分装：将储备液分装至单次用量规格，以减少冻融次数，于-20°C避光保存。

注意：细胞培养基或检测缓冲液中DMSO终浓度不应超过0.1%（v/v），以避免溶剂细胞毒性。工作液应在使用前即时将储备液稀释于预热的检测培养基中配制。

基于细胞的自噬抑制实验方案

以下通用方案介绍如何使用哺乳动物细胞系评估PIK-III对VPS34的抑制效果。针对特定细胞类型，可能需要优化浓度和处理时间。

所需材料

PIK-III DMSO储备液（P413812）
目标哺乳动物细胞系（如HeLa、MCF-7等）
适合该细胞系的完全细胞培养基
自噬诱导剂（如雷帕霉素或Earle平衡盐溶液用于饥饿处理）
自噬标志物检测抗体或试剂（如抗LC3B、抗WIPI2抗体或PI3P检测探针）

操作步骤

细胞接种：在处理前16–24小时，以适当密度将细胞接种于多孔板或培养皿中，使处理时细胞汇合度达60–80%。
化合物处理：将PIK-III储备液稀释于预热的完全培养基中至所需工作浓度。典型工作浓度范围为100 nM至10 µM，具体取决于实验终点；请参考文献获取特定细胞类型的IC50值。吸除细胞原有培养基，替换为含PIK-III的培养基。
孵育：于37°C、5% CO2条件下孵育所需时间（急性VPS34抑制通常为1–4小时）。
自噬诱导（可选联合处理）：如实验设计需要，可同时加入自噬诱导剂进行拯救或联合实验。
终点分析：通过免疫荧光显微镜（LC3B点状结构、WIPI2焦点）、Western印迹（LC3-I/II转化、p62/SQSTM1积累）或FYVE域探针检测PI3P，评估自噬抑制情况。
对照设置：每次实验均须设置溶剂对照（等量DMSO浓度）及自噬抑制阳性对照（如巴弗洛霉素A1）。

故障排除与使用技巧

以下指导针对使用PIK-III时常见问题提供解决建议：

在水性介质中溶解性差或析出沉淀：始终在无水DMSO中配制储备液，并逐步稀释至水性缓冲液或培养基中。稀释前将培养基预热至37°C有助于维持溶解性。终浓度DMSO不得超过推荐的0.1%（v/v）。
自噬抑制效果不稳定：确保储备液完全溶解，工作液现配现用。不同细胞系基础自噬流的差异也可能导致结果变异。请针对每种细胞模型经验性地优化PIK-III浓度和处理时间点。
高浓度下的细胞毒性：在每个测试浓度下评估细胞活力（如MTT或CellTiter-Glo法）。使用最低有效浓度以减少脱靶细胞毒性效应。
化合物降解：通过单次用量分装避免反复冻融。请勿储存工作液，每次实验前新鲜配制。所有溶液均须避光保存。
选择性问题：当浓度超过推荐范围时，PIK-III可能抑制其他PI3K家族成员。请将工作浓度控制在同行评审文献报道的经验证范围内。

安全、操作及法规注意事项

PIK-III仅供研究使用，未经批准用于人类或兽医诊断或治疗目的。操作时应遵守以下注意事项：

个人防护装备（PPE）：处理PIK-III及其溶液时，须穿戴适当的实验室外套、耐化学品手套及护目镜。
危害信息：PIK-III的具体GHS危害分类请参阅Aladdin Scientific提供的安全数据表（SDS）。应将其作为潜在有害研究化学品进行处理。
废弃物处置：按照当地机构、地区及国家化学废弃物处置法规处置PIK-III溶液及受污染材料。
DMSO渗透性：注意DMSO可迅速渗透皮肤，并可能携带溶解的化合物经皮吸收。处理PIK-III的DMSO溶液时须特别谨慎，使用耐溶剂手套。
记录管理：准确记录批次号、配制浓度及实验条件，以确保实验可重复性及合规性。

常见问题

在基于细胞的自噬实验中，PIK-III推荐的起始浓度是多少？

根据细胞系和实验终点，通常以100 nM至10 µM作为起始浓度范围。建议进行剂量-反应实验，以确定特定细胞模型的最佳浓度，因为不同细胞类型对VPS34抑制的敏感性可能存在差异。

PIK-III可以直接溶于水性缓冲液中吗？

PIK-III的水溶性有限，应首先溶于无水DMSO中配制高浓度储备液，再将DMSO储备液稀释至适当水性培养基或缓冲液中制备工作液。工作液中DMSO终浓度不应超过0.1%（v/v），以避免溶剂相关的细胞毒性。

PIK-III应如何保存以维持稳定性？

PIK-III应于-20°C干燥避光环境中保存。DMSO储备液应分装为单次用量，以避免反复冻融导致化合物随时间降解。工作液应在每次实验前新鲜配制，不得储存。

在自噬实验中使用PIK-III时应设置哪些对照？

每次实验均应设置溶剂对照，其DMSO终浓度与PIK-III处理样品相同。同时建议设置自噬抑制阳性对照（如阻断溶酶体酸化的巴弗洛霉素A1），以验证实验系统的有效性。设置自噬诱导阳性对照（如雷帕霉素处理或营养饥饿细胞）有助于确认实验的动态范围。

PIK-III对VPS34相较于其他PI3K亚型是否具有选择性？

是的，PIK-III被报道为VPS34（III类PI3K）的选择性抑制剂，对I类PI3K亚型（PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ、PI3Kδ）及II类PI3K成员的活性显著更低。这种选择性使PIK-III成为研究VPS34特异性生物学的重要工具。但应在每个实验系统所用浓度下验证其选择性，因为极高浓度可能降低亚型选择性。

参考文献

Dowdle WE, et al. Selective VPS34 inhibitor blocks autophagy and uncovers a role for NCOA4 in ferritin degradation and iron homeostasis in vivo. Nature Cell Biology, 2014.
Bago R, et al. Characterization of VPS34-IN1, a selective inhibitor of Vps34, reveals that the phosphatidylinositol 3-phosphate-binding SGK3 protein kinase is a downstream target of class III phosphoinositide 3-kinase. Biochemical Journal, 2014.
Selleck Chemicals. PIK-III Product Information Sheet, Catalog No. S7683.

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。