CTAB粗提法原理

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法是从植物组织中提取基因组DNA最常用的方法之一。CTAB是一种阳离子去污剂，能够破坏细胞膜并与核酸形成复合物，从而将DNA从植物细胞中大量存在的多糖及其他杂质中选择性沉淀出来。

在粗提法变体中，操作步骤经过简化，在减少操作环节的同时，仍能获得满足大多数下游实验需求的DNA，包括PCR扩增、限制性内切酶消化和凝胶电泳。该方法依托含CTAB缓冲液进行细胞裂解，随后通过有机溶剂萃取去除蛋白质和脂质，并选择性沉淀DNA。

对于富含次生代谢物、多酚和多糖的植物物种，该方法尤具优势，因为上述杂质若未充分去除，将抑制酶促反应。

材料、试剂与仪器设备

试剂盒组成（具体体积及浓度请参阅试剂盒说明书）：

• CTAB提取缓冲液
• 氯仿：异戊醇（24:1）或等效有机溶剂混合液
• 沉淀试剂（如异丙醇或乙醇）
• 洗涤缓冲液
• 洗脱缓冲液或无核酸酶水

所需附加材料（试剂盒不包含）：

• 液氮或珠磨仪（用于组织匀浆）
• 研钵和研杵（预冷）
• 微量离心管（1.5 mL或2 mL）
• 可达≥12,000 × g的微量离心机
• 设定65 °C的水浴锅或加热模块
• 涡旋振荡器
• 移液器及带气溶胶屏障的吸头
• 冰桶

注：试剂盒组分的确切信息请以货号P1527546（leagene #NE0205）随附说明书为准。

分步提取操作流程

1. 样品制备
采集新鲜植物组织（通常为50–100 mg叶片材料），立即置于液氮中冷冻。使用预冷的研钵和研杵将组织研磨成细粉末，迅速转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。研磨过程中避免样品解冻，以防DNA降解。

2. 细胞裂解
向研磨好的组织中加入适量预热至65 °C的CTAB提取缓冲液，剧烈涡旋混匀。于65 °C孵育30–60分钟，每隔10分钟轻柔颠倒混匀一次，以促进充分裂解。

3. 有机溶剂萃取
将裂解液冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻柔颠倒混匀10分钟。于室温12,000 × g离心10分钟，小心吸取上层水相转移至新管，避免触及中间层。

4. DNA沉淀
向水相中加入0.6–1倍体积的异丙醇（或按说明书要求），轻柔颠倒混匀。于−20 °C孵育20–30分钟以增强DNA沉淀。于4 °C、12,000 × g离心10分钟，小心弃去上清液。

5. 洗涤
用冷的洗涤缓冲液（如75%乙醇）洗涤DNA沉淀，于7,500 × g离心5分钟，彻底弃去洗涤液，室温晾干沉淀5–10分钟。切勿过度干燥，否则沉淀难以溶解。

6. 洗脱与储存
将DNA沉淀溶于适量洗脱缓冲液或无核酸酶水中，如需促进溶解可于55–65 °C孵育5分钟。提取的DNA可于−20 °C长期储存，或于4 °C短期保存。

注：所有体积和孵育时间请以货号P1527546官方说明书为准。

提取DNA的质量评估

紫外分光光度法分析：
使用紫外分光光度计（如NanoDrop）测定DNA浓度和纯度。A260/A280比值在1.8–2.0之间表明DNA基本不含蛋白质。A260/A230比值高于1.8说明多糖、CTAB残留及酚类化合物已被有效去除。若比值超出上述范围，则需进一步纯化。

琼脂糖凝胶电泳：
取200–500 ng提取的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。高质量基因组DNA应在10 kb以上呈现清晰、锐利的条带。主带下方的弥散条带提示DNA降解，高分子量区域弥散的条带可能表明裂解不完全或有RNA共纯化。

功能验证：
使用看家基因引物进行测试PCR，以确认DNA是否适用于下游实验。目的条带的成功扩增表明DNA质量满足要求。

常见问题排查指南

问题：DNA产量低
可能原因：起始组织量不足；细胞裂解不完全；有机萃取或沉淀步骤中DNA损失。
解决方案：在推荐范围内增加起始组织用量；确保组织研磨成细腻粉末；确认裂解步骤的孵育温度和时间；弃上清时避免扰动沉淀。

问题：DNA纯度不佳（A260/A280或A260/A230偏低）
可能原因：蛋白质或多糖污染；有机溶剂残留；CTAB残留。
解决方案：重复氯仿：异戊醇萃取步骤；洗脱前确保洗涤缓冲液被彻底去除；考虑增加乙醇沉淀步骤。

问题：DNA降解（凝胶上出现弥散条带）
可能原因：内源性DNase活性；研磨过程中样品解冻；操作时间过长。
解决方案：快速操作并在全程保持低温；若CTAB缓冲液中尚未加入β-巯基乙醇，可酌情添加（请参照说明书确认）；使用新鲜植物材料。

问题：DNA表观质量良好但PCR受到抑制
可能原因：残留多酚、CTAB或多糖作为PCR抑制剂。
解决方案：PCR前将DNA稀释5–10倍；进行额外纯化（如PVPP处理或柱纯化）；核查A260/A230比值。