产品简介

         FeRhoNox-1（又称 RhoNox-1）是一种用于检测细胞内游离亚铁离子（Fe²⁺）的活细胞荧光探针。该探针具有良好的细胞膜通透性和较高的金属离子选择性，适用于活细胞内Fe²⁺的荧光成像，倾向定位于高尔基体。

       FeRhoNox-1在未与Fe²⁺反应时荧光极弱；当与Fe²⁺发生特异性反应后，会不可逆生成一种橙红色荧光产物，其典型光谱特征为：

(a) 最大吸收波长（Abs max）：约 540 nm

(b) 最大发射波长（FL max）：约 575 nm

       在37℃条件下，FeRhoNox-1与Fe²⁺反应约1 h后，荧光强度显著增强（见图 1）。在生理相关浓度范围内，铁(III)（Fe³⁺）及其它常见二价金属离子一般不会显著增强其荧光信号，表现出对Fe²⁺的较高选择性（见图 2：FeRhoNox-1的选择性和反应特异性）。

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图 1. FeRhoNox-1的光谱特征FeRhoNox-1 与Fe²⁺反应后产物的吸收光谱与发射光谱示意。最大荧光发射峰约在575nm。

图 2. FeRhoNox-1的选择性FeRhoNox-1 在常见金属离子存在时的荧光响应比较，仅对Fe²⁺显示明显的荧光增强。

活细胞内Fe²⁺荧光染色与检测操作流程

Ⅰ 实验前需自备试剂与材料

1. 高质量DMSO

(1) 细胞培养级或超纯DMSO

(2) 强烈建议将高纯DMSO分装成单次用量的小管，置于−80℃冰箱保存，使用时现取。

(3) DMSO极易吸潮并可能缓慢降解，降解的DMSO可能增加FeRhoNox-1的背景信号。

2. 适用于细胞的中性缓冲液（不含酚红）

示例：

(1) PBS（pH 7.2–7.4，无 Ca²⁺/Mg²⁺ 或按需要选择）

(2) HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

(3) 其他适合细胞的中性缓冲液

注意：

(4) 缓冲液中不要含有酚红，以避免对荧光检测造成干扰。

(5) 染色与洗涤步骤建议使用无血清缓冲液，以减少血清蛋白对铁离子分布及信号的影响。

Ⅱ 探针配置（FeRhoNox-1 储存液与工作液）

粉末复溶为1 mM储存液

1. 从−20℃冰箱中取出FeRhoNox-1，置于室温回温至少30 min。

2. 将试剂管置于微量离心机内，低速离心数秒，使管壁粉末全部沉至管底。

3. 向一管FeRhoNox-1（50 μg）中加入109 μL高质量DMSO。

4. 用移液枪反复吹打≥ 5次，直至完全溶解，即得1 mM FeRhoNox-1 DMSO储存液。

5. 若不能一次用完：

(a) 按单次用量分装于避光小管中

(b) 置于 −80℃ 避光保存

(c) 避免重复冻融

建议实验时尽量一次用完一支小分装，以保证信噪比和重现性。

Ⅲ 配制工作液

在正式实验前，用HBSS或其他中性缓冲液将1 mM FeRhoNox-1 储存液稀释至所需工作浓度，例如：

(1) 5 μM FeRhoNox-1工作液

(a) 配制示例：取 5 μL 1 mM 储存液加入至1 mL缓冲液中，即得5 μM工作液。

重要提示：

(2) FeRhoNox-1工作液需现配现用，尽量在短时间内使用完毕。

(3) 避免长时间放置于室温或强光下，以防探针降解或荧光背景升高。

Ⅳ 细胞染色步骤

以下步骤以玻璃底培养皿中贴壁细胞为例，可根据实际实验体系适当调整。

1. 弃去培养基

(a) 从 37℃ 培养箱中取出细胞培养皿，小心吸尽培养基。

2. 细胞洗涤

(a) 加入适量预温的 HBSS 或 PBS（不含酚红、无血清），轻柔覆盖细胞。

(b) 轻轻晃动后吸去，重复洗涤2次，以去除残余培养基和血清成分。

3. 加入染色工作液

(a) 向培养皿中加入含有5 μM FeRhoNox-1的染色工作液，确保完全覆盖细胞。

4. 孵育

(a) 将细胞置于37℃，5% CO₂ 培养箱中孵育30–60 min。

(b) 不同细胞类型对孵育时间的敏感性略有差异，可根据实际信号强度和细胞状态进行优化。

5. 孵育后洗涤

(a) 孵育结束后，弃去染色液，用HBSS 或PBS洗涤细胞2–3次，以去除游离探针和未结合的 Fe²⁺。

6. 观察或检测

(a) 洗涤后可继续加入少量HBSS或适合成像的缓冲液覆盖细胞。

(b) 立即在荧光显微镜下观察，或按实验设计进行流式细胞术等其他检测。

Ⅴ 荧光检测条件

荧光显微成像

(1) 激发滤片：可使用通用的绿色激发滤片，例如用于Cy3或四甲基罗丹明（TMR） 的滤片。

(2) 发射波段：检测波长中心建议设置在570–580 nm左右。

激光共聚焦成像

(1) 激光激发波长：推荐使用532 nm或543 nm激光器。

(2) 发射检测：设置发射收集窗口在约 570 nm附近，可根据仪器配置适当调整带宽。

实际参数可根据所在实验室显微镜/共聚焦配置进行微调，以获得最佳信噪比。

Ⅵ 注意事项与安全防护

1. 细胞内定位与信号解读

(a) FeRhoNox-1倾向定位于高尔基体，但也可能部分反映细胞质内游离Fe²⁺ 池的变化。

(b) 目前对其在各类细胞中详细的亚细胞定位选择性尚缺乏系统评估，解读信号时需结合其他标记和实验设计综合判断。

2. 避免酸性环境

(a) 酸性溶液会氧化FeRhoNox-1，从而严重影响探针与Fe²⁺的特异性反应效率。

(b) 实验中请尽量使用pH 7.2–7.4 的中性缓冲液，避免在明显酸性条件下处理探针或样品。

3. 避光操作，减缓荧光淬灭

(a) 与大多数荧光染料类似，FeRhoNox-1 及其荧光产物在光照下会发生不同程度的光漂白（淬灭）。

(b) 配液、孵育和成像过程中，应尽量避光或弱光操作，以减缓荧光淬灭并提高信号稳定性。

4. DMSO与细胞毒性

(a) DMSO浓度过高可能对细胞产生毒性，配制工作液时应确保终浓度控制在细胞可耐受范围内（通常 ≤0.1%–0.5%，视细胞类型而定）。

5. 安全防护

(a) 为了您的安全和健康，操作过程中请务必：

§ 穿着实验服

§ 佩戴一次性手套

§ 必要时佩戴护目镜

(b) 按照所在单位的化学品安全和生物安全规范处理废液和废弃物。

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