DNA 酶 I 足迹分析是检测和鉴定转录因子对 DNA 的序列特异性结合能力的一种有效方法（Galas 和 Schmitz,197S)。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

DNA酶I足迹探针的制备实验

材料与仪器

TE 牛肠碱性磷酸酶缓冲液 T4 多核苷酸激酶缓冲液 TBE 加样缓冲液 TBE 质粒 DNA 合适的限制酶 粉 氯仿 氯仿 异戊醇（3-甲基-1-丁醇） 乙醇 牛肠碱性磷酸酶 [γ-32P]ATP T4 多核苷酸激酶 乙酸铵 乙酸钠 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 过硫酸铵 TEMED
SpeedVac 旋转浓缩器

步骤

材料与设备

质粒 DNA(含待分离序列特异性 DNA 结合因子的识别位点)

合适的限制酶

粉/氯仿（1:1;v/v)

氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)

乙醇（100% 和 75%;v/v)

牛肠碱性磷酸酶（BoehringtrMannheimCorp.713023)

[γ-³²P]ATP(150uCi/ul;7000Ci/mmol;21pmol/ul)

T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)

乙酸铵 (2.5mol/L)

乙酸钠 (3mol/L)

SpeedVac 旋转浓缩器（Savant Instruments，Inc.)

丙烯酰胺

双丙烯酰胺

过硫酸铵

TEMED(N,N,N'，N'-四甲基乙二胺）

试剂

TE

牛肠碱性磷酸酶缓冲液（10x)

T4 多核苷酸激酶缓冲液（10x)

TBE 加样缓冲液（5X)

TBE(10x)

(配方，见“试剂的配制” pp.131~138.)

操作程序

质粒 DNA

用于制备 DNA 酶 I 足迹探针的质粒 DNA 必须是高质量的（CsCl 纯化的)，其 RNA 杂质的含量必须很低。RNA 杂质会抑制激酶的反应。我们一般采用连续两步 CsCl 梯度法纯化 DNA。

第一次限制酶切消化

第一次限制酶切消化的目的是形成 5'突出端。酶切位点的位置应在离因子结合位点 50~200bp 范围内。

1) 质粒 DNA(50ug 的量较方便) 与第一个限制酶一起孵育，用琼脂糖凝胶电泳监测反应是否完全。

2)DNA 用 1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。

3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul。

去除 5'端的嫌酸

1) 每微克 DNA 中加入 1U 牛肠碱性磷酸酶 [例如，为使 50ugDNA 脱磷酸, 需在 500ul 总体积中加入 50U 磷酸酶（50U=50ul)〕。37°C 孵育 2 h。

2)DNA 用酚、1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。

3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul

注；一个便利的办法是将大量 (≥50ug)DNA 酶切消化和脱磷酸后作为储液储存起来，需要时标记少量 (一般为 5ug)DNA 备用。

标记 5'端

1) 于含 2ul 10xT4 多核苷酸激酶缓冲液的 11ul 水溶液中加入 5ul 经酶切消化和脱磷酸的 DNA(1ug/ul; 总量 5ug;5pmol5'端)，震荡混合。

2) 对此混合物，加入 1ul[γ-³²P]ATP(标记 ATP 与 DNA5'端的摩尔比应为 2~4)，然后加入 1ul T4 多核苷酸激酶（此激酶是过量的)，反应终体积为 20ul。

3)37°C 孵育 1~2 h。

4) 加 200ul 2.5 ml/L 乙酸铵，震荡混合。微型离心机离心 0.5s, 使溶液回到离心管底部。

5)70°C 加热 15 min, 使激酶失活。置冰上冷却。

6) 加 660ul 100% 乙醇，颠倒混合 a 微型离心机离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。

注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。

7) 加 100ul TE, 震荡混合，溶解 DNA。

8) 加 100ul 1:1 酚/氯仿，震荡混合 1 min, 离心 5 min, 使分相。

9) 将上层转移至一新管，加入 10ul 3 ml/L 乙酸钠，震荡混合。

10) 加 300ul 100% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。

注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。

11) 加 800ul 75% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。

注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀，并确认沉淀有适量水平的放射性。

12) 用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀。

13)DNA 溶于 10ulTE。

第二次限制酶切消化

第二次限制酶切消化的目的是产生 200~800bp 的标记 DNA 片段。

1) 探针 DNA 与第二种限制酶孵育。为保证此反应进行完全，建议尽可能地使用大大过量的酶，如対 5~10ug 的 DNA 甲 50~100U 的限制酶。

注：应注意限制酶的磷酸酶活性。通常用廉价的酶如 EcoRⅠ和 HindⅢ较合适。反应 80ul体积中进行较为方便。如需要，可用琼脂糖凝胶电泳监测反应的进程。

2) 用 1:1 酚/氯仿抽提 DNA。然后于 80ulDNA 中加入 20ul5xTBE 加样缓冲液，直接加样至 5% 聚丙烯酰胺（非变性) 凝胶。

标记限制酶切片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳

1) 按下列配方制备聚丙级酰胺凝胶 (20 cmX40 cmX1.5 mm; 有 4 个 3-cm 加样孔）：

丙稀酰胺 (30%;w/v)/双丙插醜胺 (0.8%;w/v)20.3 ml

TBE(10x)12.5 ml

H2092.2 ml

混合后过滤，然后加 750ul 10%(w/v) 过硫酸铵和 60ul TEMED。

2) 凝胶至少聚合 45 min，然后在 19W(约 400V) 下预电泳至少 lh。电泳时胶不应变热。

3) 加样，电泳一段所需时间后. 电压会缓慢地从 400V 增至 450~500V。

注：二甲苯腈蓝在 5% 胶上与 300-bp 限制酶切片段一起迁移。

从聚丙烯酰胺凝胶洗脱 DNA
本法用于≤8% 的聚丙烯酰胺凝胶，效果良好

1) 从胶板上切下有放射性的条带，应尽量减小条带的大小。

2) 用 18-G 号针（粉红色）在 l.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。

3) 将有孔的微量离心管底部插入另一 1.5-ml 微量离心管（无孔）中。

4) 将切下的胶块放入上一个有孔的微量离心管中。

5) 将两个微量离心管一起放在微型离心机中离心 15s。胶块通过小孔进入下一个微量离心管时应被破碎。

6) 加 300ul TE, 震荡混合。

7)37°C 孵育过夜。

8) 用 20-G 号针（黄色）在 1.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。在管底小孔之上填装约 200ul(装填结实后的体积) 硅化玻璃棉。硅化玻璃棉应装填结实于管底。然后，将此管的底部插入另一 1.5-ml微量离心管（无孔）中。用一尖端被刀片切去大约 2~3 mm 的 1000-ul 吸头（蓝色)，将 TE 和破碎胶块的混合物置于玻璃棉上，将这两个微量离心管制成的装置放在微型离心机中离心 10s。下管中应含有 TE 洗脱的 DNA 片段。

9) 乙醇沉淀探针 DNA, 然后溶于 TE。

10)-20°C 保存。

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