肝素（Heparin）是一类酸性粘多糖，对碱和热较稳定，在生物体内以与蛋白质结合的复合物形式存在，常用的是盐解和酶解法分离，然后加热过滤将其除去。由于肝素分子在碱性条件下有很强的负电性，所以在一定的pH和离子强度下可被阴离子交换树脂吸附，经富集、洗脱、沉淀可获得粗制品。（来源：生物化学与分子生物学实验指导，邵雪玲 等，武汉大学出版社，2003）

操作方法

离子交换法

原理

测定肝素的方法主要有生物测定法、紫外分光光度法、化学法。肝素分子具有强负电性，能与带正电荷的分子结合生成复合物。天青A是一种碱性染料，和肝素生成的复合物表现出“光异色现象”，即改变染料原有的吸收光谱。控制染料浓度，在pH 8.6介质中肝素浓度低时，505 nm的光吸收与肝素浓度的关系符合朗-比尔定律。

材料与仪器

肠粘膜或猪肝
巴比妥缓冲液 阿拉伯胶 天青A 肝素
烧杯 试管 试管架 玻棒 磁力搅拌器 电炉 吸滤瓶 布氏漏斗 离心机 722分光光度计 容量瓶 真空干燥器 真空泵 水浴锅 滤纸 布袋。精密pH试纸

步骤

溶液配制：

1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6，0.05 mol/L)：称取1 g氢氧化钠溶于50 ml沸水  ，再精确称取二己基巴比妥酸5052  g溶于上述溶液中，冷却后稀释至500 ml，pH计校正到pH8.6。
 
2. 0.1%阿拉伯胶溶液：称取0.5 g，先用少量水分散，再稀释至500 ml，过滤备用。
 
3. 0.1%天青A溶液(称取0.5 g，先用少量水在研钵中研磨溶解，再稀释至500 ml，过滤，冰箱储备。用时再稀释5倍。
 
4. 肝素标准溶液：准确称取一定量的肝素标准品，用灭菌水配成100 U/ ml的标准溶液，冰箱暂放  ，用时以水稀释100倍。

操作步骤： 
 
1.提取（盐解法）

新鲜猪肠粘膜2 kg（或猪肝捣碎），加入氯化钠80 g（4%浓度），搅拌溶解后用40%氢氧化钠溶液调p H至9.0（用广泛pH试纸），水浴加热至50～55 ℃搅拌提取2 h，然后升温至90℃保持10 min，冷却至60 ℃用布袋过滤，取滤液待离子交换用。
 
2.离子交换

将滤液用水稀释3倍，加入D254树脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速搅拌6 h（可每隔1 h抽样测定提取液中剩余肝素的含量），过滤取树脂。
 
3.洗涤、洗脱

取离子交换后的树脂先用自来水洗净，而后用蒸馏水洗净。取洗净树脂加入等体积1.4 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌1 h，过滤取树脂。继续用0.5倍体积的5 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤收集滤液（取样测含量）。树脂再加入0.5倍体积的3  mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌1 h，过滤，滤液收集（取样测含量）。树脂再用0.5倍3 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤，滤液收集（取样测含量），合并三次洗脱滤液。
 
4.粗制肝素

取合并滤液加入1.5～2倍体积的95%乙醇洗一次，丙酮洗两次，真空干燥即得粗品肝素。
 
5.精制肝素

称取粗制肝素粉末用1%氯化钠溶液（预冷却）适量溶解，调pH1.8左右，离心15  min，上清液经砂心漏斗去除离心液表面的脂肪。悬液在水浴上加热至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高锰酸钾溶液（按0.1～0.2 mol/亿单位），用滤纸法检测终点，滤液加入30%过氧化氢，调p H至11，放置36 h（冰箱内）。抽滤，滤液调pH至6.4，加入1倍体积的95%乙醇，离心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗两次，真空干燥即得精制肝素。
 
6.天青法测定效价
 
（1）标准曲线的制作:取较大试管（易混匀）6支，以0～5编号，按下表操作。加入阿拉伯胶后必须摇匀方可加入染料，混匀后用722型分光光度计测505 nm处吸收值，以吸收值为纵坐标，单位数为横坐标绘制标准曲线。
 
（2）样品测定:精确称取样品约10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2个100 ml容量瓶稀释为1 mg/100 ml溶液、2  mg/100 ml测定液，按下表操作并记录吸收值，分别从标准曲线上查出相应单位数，按下式计算样品效价，取平均值。

单位为U/ mg ，式中Pi 为由A 值在标准曲线上查出的单位数；V 为测定样品的总毫升数；Vi 为测定所用样品的毫升数；Sw 为称取样品的毫克数。

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