这是一种将酶或蛋白质如过氧化物酶或抗体，共价固定在琼脂糖或交联葡聚糖的有效方法。这种方法的严重不足是所用试剂毒性很高，推荐使用从公司购买的产品（如 CNBr-活化的琼脂糖）。由于活化需在强碱条件下进行，凝胶的结构有可能被损坏，因此要快速进行。来源：《酶学实验手册》

操作方法

基本方案

材料与仪器

蛋白质
琼脂糖 4B NaOH 溴化氰 NaHCO3 氨基乙酸 乙酸钠-乙酸 磷酸二氢钾
天平 烧瓶 螺旋搅拌器 布氏漏斗

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

1. 制备 CNBr-活化的琼脂糖 4B

以下步骤必须在通风橱中小心进行。用 3 mol/L NaOH 将琼脂糖 4B 悬液调整为 pH 11.2，用 pH 计进行检测。在天平上放置一烧瓶，重量归零，将 0.67 g 固体 CNBr 溶解在少量水中，小心塞住烧瓶口。边搅拌（KPG 或螺旋搅拌器，不要用磁力搅拌器）边将 CNBr 溶液小心加入凝胶悬液中，持续保持 pH 11.2，可用 3 mol/L NaOH 调节。当 pH 6 min 保持不变时，立刻用 1 L 水通过布氏漏斗或玻璃料冲洗凝胶。

2. 连接蛋白

冲洗 CNBr-活化的琼脂糖悬液（20 ml）并转移到相同体积的 0.1 mol/L NaHCO₃ 溶液，pH 8.2。加入 0.5 mol/L NaCl 和 0.2 g 蛋白质。悬液室温振荡 3 h 或 4℃ 过夜。测定上清中的蛋白质含量从而确定被固定的蛋白质量。加入 5 ml 1 mol/L 氨基乙酸以封闭剩余活性基团。首先用 0.1 mol/L pH 4.0 乙酸钠-乙酸冲洗凝胶，再用 0.1 mol/L pH 7.6 的磷酸二氢钾冲洗。为了储存凝胶，最后还需加入 NaN₃，使其终浓度达到 0.1 mol/L。

常见问题

试剂：

琼脂糖 4B，悬液，6.6 g 溶于 20 ml H₂O

3 mol/L NaOH（Mr＝40.0；12 g 溶于 100 ml 水中）

溴化氰（CNBr，Mr＝105.9）

0.1 mol/L NaHCO₃（Mr＝84.0；0.84 g/L 100 ml）pH 8.2，含 0.5 mol/L NaCl（Mr＝58.4；2.92 g/100 ml）

1 mol/L 氨基乙酸（Mr＝75.1；1.5 溶于 20 ml H₂O）

0.1 mol/L 乙酸钠-乙酸，pH 4.0

0.1 mol/L 磷酸二氢钾，pH 7.6

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