实验方案（Protocols）

蛋白质Tris-Tricine电泳系统标准操作规程

· · 发布于 2025年11月17日 · 更新于 2025年11月17日 ·

1.实验器材

垂直电泳系统：电源、电泳槽及配套附件。
制胶组件：厚板（spacer plate，1.0 mm）、薄板（short plate）与塑料框架。
移液工具：微量移液器及吸头（1 mL、200 μL、10 μL）。
离心与储存耗材：离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）。
玻璃器皿：烧杯、容量瓶（100 mL）、量筒（100 mL、500 mL、1000 mL）、玻璃棒。
试剂容器：广口试剂瓶（500 mL、1000 mL）、棕色瓶（250 mL、500 mL）。
实验耗材：滤纸、无尘擦拭纸、保鲜膜/密封袋。
计量与监测：pH计等。

2.实验试剂

2）40%丙烯酰胺:N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（29:1）(40% Acr-Bis)浓缩胶

组分	用量
丙烯酰胺	38.67 g
甲叉双丙烯酰胺	1.33 g
ddH₂O	定容至100 mL

配制后4℃避光储存

3）40%丙烯酰胺:N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（19:1）(40% Acr-Bis)分离胶

组分	用量
丙烯酰胺	38 g
甲叉双丙烯酰胺	2 g
ddH₂O	定容至100 mL

配制后4℃避光储存。

4）10% APS

配置方法（10 mL）：

①称取过硫酸铵（APS）1.00 g于15 mL离心管；

②加入双蒸水至约8–9 mL，振荡溶解后定容至10.0 mL；

③现配现用或4℃避光保存（≤1周）。如需更长时间保存，可按0.5–1.0 mL/管分装，-20℃避光保存并避免反复冻融；使用前建议做小试验证聚合效果。

注意：

①固体过硫酸铵（APS）易吸湿潮解并失活，建议采购小包装或购后立即分装；密封置于干燥处保存，或 –20 ℃ 冻存并配干燥剂、避光。

②小包装开启后一次性配制母液，随后按 1.0 mL/管分装于 1.5 mL 离心管，–20 ℃ 冻存；取用时单管解冻即用，避免反复冻融与回灌。

③贮存与操作要点：容器保持干燥洁净，尽量缩短开启暴露时间；避免金属离子污染与高温、强光。母液建议小批量现配，长期存放前可经滤膜除微粒。

④质量监控：若出现结块、变色或配制后起始反应迟缓，视为活性下降，弃用重配。

5）TEMED

6）4×多肽电泳凝胶缓冲液（3M Tris-HCl ; 0.4% SDS, pH 8.45）

组分	用量
Tris	182 g
SDS	2.0 g（20 mL 10%SDS）
盐酸	1 mol/L调节pH8.45
ddH₂O	定容至500 mL

配制后4℃储存。

7）10×Tris-tricine-SDS电泳缓冲液（使用前稀释为1×）

按下表配制10×TTS（定容至1000 mL），4℃保存。使用时取50 mL 10×TTS加450 mL超纯水配成1×TTS用于电泳。

组分	终浓度	用量
Tris	1 M	121.14 g
Tricine	1 M	179.2 g
SDS	1%	10 g
ddH₂O	定容至1000 mL

8）1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）蛋白样品缓冲液（100 mL）

配置方法（100 mL）：

称取12.11 g Tris粉末，倒入100 mL烧杯中，加入80 mL蒸馏水，搅拌至完全溶解，用1 mol/L盐酸调至pH6.8，倒入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，4℃贮存。

9）2×Tricine蛋白样品加样缓冲液（10 mL）

组分	终浓度	用量
Tris-HCl（1 M，pH 6.8）	100 mM	1 mL
Glycerol	24%	2.4 mL
SDS	8%	0.8 g
DTT	0.2 M	0.31 g
考马斯亮蓝G-250	0.02%	2 mg
ddH₂O	定容至10 mL

10）染色液

组分	用量
冰醋酸	50 mL
甲醇	250 mL
考马斯亮蓝G-250	0.25 g
ddH₂O	定容至500 mL

11）脱色液

组分	用量
甲醇	200 mL
冰醋酸	70 mL
ddH₂O	定容至500 mL

12）18%Tris-Tricine凝胶配方

分离胶（T=18% C=5%）	5 mL	8 mL	10 mL	16 mL	25 mL	32 mL
乙二醇	1.50	2.40	3.00	4.80	7.50	9.60
40% Acr-Bis (19:1)	2.25	3.60	4.50	7.20	11.25	14.40
凝胶缓冲液	1.25	2.00	2.50	4.00	6.25	8.00
10% APS	0.038	0.060	0.075	0.120	0.188	0.240
TEMED	0.004	0.006	0.008	0.012	0.019	0.024

浓缩胶（T=5% C=3.3%）	1 mL	2 mL	3 mL	4 mL	5 mL	6 mL
ddH₂O	0.612	1.22	1.83	2.45	3.06	3.67
40% Acr-Bis (29:1)	0.125	0.25	0.38	0.50	0.63	0.75
凝胶缓冲液	0.250	0.50	0.75	1.00	1.25	1.50
10% APS	0.013	0.025	0.038	0.050	0.063	0.075
TEMED	0.001	0.002	0.003	0.004	0.005	0.006

3.聚丙烯酰胺凝胶的配制（18%T、5%C / 6 mL 分离胶；5%T、3.3%C / 4 mL 浓缩胶）

（1）凝胶模具准备

①依据实验目的选择玻璃板厚度；对小分子蛋白的电泳观察与转膜，优先采用较薄规格（如1.0 mm、0.75 mm）。

②以75%（v/v）乙醇均匀擦拭脱脂，复以蒸馏水冲洗；用无尘擦拭纸拭干，去除微粒与指印。

③按说明书将厚板（spacer plate）与薄板（short plate）装配并固定于灌胶器，确认密封完好与夹持均匀。

（2）配制分离胶

①以1 mL移液器沿玻璃板内侧缓慢灌注分离胶溶液；液面至前板顶端下约1.5 cm，或距梳齿约0.5 cm即止。

②于分离胶表面覆盖约1 cm蒸馏水，使液面平整并隔绝空气。

③室温静置30–60 min；当分离胶与上层水形成清晰界面即视为聚合完成。弃去上层水，倾斜玻板以滤纸吸尽残留水分。

④配制浓缩胶，沿玻璃板内侧缓慢灌注至接近玻板顶端；垂直插入梳子形成上样孔，静置30–60 min聚合。

⑤凝固后，将胶连同玻板装入电泳槽；加入电泳缓冲液后小心拔除梳子，按序准备上样电泳。若需暂存，可连板置于自封袋密封，4℃保存（袋内可加少量蒸馏水以维持湿度）。

4.蛋白电泳

（1）样品准备

①预热水浴锅或干式金属浴至70–100 ℃。

②将所需量蛋白样品转移至1.5 mL微量离心管，按顺序编号并记录。

③按规定比例加入上样缓冲液，轻混均一。

④置于水浴/金属浴加热10–15 min。

⑤取出冷却至室温，瞬时离心10–30 s收集液体。

⑥按编号整理样品，备用上样。

（2）电泳

①将凝胶以上样孔朝上装入电泳槽；分别向内、外槽加入电泳缓冲液：外槽液面需覆盖电极/铂丝，内槽加至完全淹没上样孔。

②垂直、缓慢拔出梳子；上样前以移液器吸取少量缓冲液对各上样孔轻吸排，去除残胶与气泡。

③采用微量移液器按既定顺序加样并记录。

④设定恒压150 V运行，起始电流约45–55 mA、末端电流约10–15 mA，电泳2–3 h；当溴酚蓝前沿到达分离胶下缘时终止。

操作提示：

操作提示：

①优先使用凝胶上样专用吸头，确保样品完整注入上样孔。

②控制上样体积，避免过载与溢入相邻孔，以防条带干扰。

③吸头插入深度勿触及孔底，以免造成条带扭曲；亦不宜过高，避免样品在缓冲液中弥散。

④连续完成加样，缩短样品在孔内滞留时间，降低弥散风险。

（3）染色

①将电泳结束的PAGE胶置于洁净塑料容器中。

②加入染色液至完全覆盖胶面，静置预浸1–2 min。

③室温置于摇床温和振荡10–15 min，期间避免胶片重叠。

④取出观察显色结果。

参考文献

1.Schägger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nat Protoc 1, 16–22 (2006).

2.曹佐武. 有效分离 1kDa 小肽的 Tricine-SDS-PAGE 方法[J]. 中国生物工程杂志, 2004, 24(1): 74-76.

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/

目录：实验方案（Protocols）

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《蛋白质Tris-Tricine电泳系统标准操作规程》. 阿拉丁知识库，更新于 2025年11月17日。
                            https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/protein-tris-tricine-electrophoresis-system-standard-operating-procedure.html

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