高分子量蛋白质印迹法是标准蛋白质印迹技术的一种改良，专门用于检测和分析大分子量蛋白质。

溶液和试剂

（1） 10× 电泳缓冲液

        • 首先将成分溶解在3.5 L水中，然后补足至5 L。

        • 使用时按1:10的比例稀释至1×。

（2） 1× 转膜缓冲液

        • 首先将成分溶解在3.5 L水中，然后补足至10 L。

        • 使用前，向转移缓冲液中添加10%甲醇。

（3）封闭缓冲液

        • 5% NFDM/TBST

（4） 10× TBS

        • 溶于去离子水，用HCl调节pH至7.4，然后用去离子水补足至22.5 L。

（5） 1× TBST

        • 加入2.25 L 10× TBS和22.5 mL 吐温-20，用去离子水定容至22.5 L。

（6）分离胶

（7）浓缩胶

一、上样和跑胶

实验步骤

1.将等量的蛋白质与分子量标准一起加入到SDS-PAGE凝胶的孔中。每条泳道上样20 μg总蛋白。

2.使用预冷的电泳缓冲液，在150 V下跑胶约1.5小时。

        注意：时间和电压可能需要优化。另外除非抗体数据表上建议使用非还原条件，否则应使用还原凝胶。

第 2 阶段   转膜

实验步骤

1.将凝胶浸泡在1×转膜缓冲液中40分钟。

2.用99.5%甲醇活化PVDF膜15秒。

3.转膜前将PVDF膜、滤纸、海绵浸泡在1×转膜缓冲液中30分钟。

4.使用预冷的转膜缓冲液，在4°C下以500 mA、持续1h完成湿转。

5.用去离子水清洗两次，每次10分钟，然后继续进行抗体染色。或者晾干后在4°C下暂时储存。

第 3 阶段   抗体染色

实验步骤

1.使用5%封闭缓冲液，室温下封闭膜1小时，或在4°C下封闭过夜。

2 .用1× TBST清洗膜10分钟。

3.用封闭缓冲液稀释一抗至推荐浓度，然后倒入膜上，在低温振荡器上室温孵育1小时。

4.用TBST清洗三次，每次10分钟。

5.将膜浸泡到封闭缓冲液稀释的偶联二抗中，置于低温振荡器上室温孵育1小时。

6.用TBST清洗三次，每次10分钟。

7.根据使用的偶联二抗的性质，选择对应的显色和成像方式。如使用暗室显影技术获取化学发光图像，或使用常规图像扫描方法获取比色检测图像。

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