一、基本原理概述

1.特异性结合

1）Protein A、Protein G和Protein L能够与不同种属和亚类的IgG或其他抗体分子上的特定结构域结合；

2）将这些蛋白共价偶联到琼脂糖微球表面，就形成了具有抗体亲和力的固相载体。

2.磁性分离

1）磁性琼脂糖微球内部含有磁响应材料，在外加磁场存在时，会快速聚集到靠近磁铁的一侧；

2）这样，抗体在与磁珠结合后，可以通过简单的“靠磁聚集–吸取上清”的方式完成液相与固相分离，而无需离心或柱层析。

3.整个纯化过程本质上仍然包含三个核心步骤：

1）上样（抗体结合）；

2）洗涤（去除非特异性蛋白）；

3）洗脱（改变条件使抗体从固相上解离）。

二、所需材料与缓冲体系

磁性Protein A/G/L琼脂糖微球

• 适配体积的微量离心管（或其他塑料管）
• 与管型匹配的磁性架
• 旋转或振荡混匀装置（用于温和混匀）、
• 上样/洗涤缓冲液：如1×PBS，pH 7.2–7.4
• 洗脱缓冲液：如低pH甘氨酸缓冲液（例如pH 2.5–3.2）
• 中和缓冲液：如高浓度Tris缓冲液（例如0.5–1 M，pH 8–9）
• 用于分析的SDS-PAGE胶与配套电泳缓冲液
• 吸光度测定或蛋白定量试剂

三、实验步骤

步骤一：磁珠预处理与平衡

1.重悬与取样

1）轻柔倒置磁珠悬液数次，使微球均匀分布；

2）按计划的树脂体积（例如0.05–0.2 mL实际树脂）吸取相应悬液至离心管。

2.去除保存液

1）将离心管放入磁性架中，待磁珠完全聚集于管壁后，吸除上清（含乙醇的保存液）；

2）注意不要扰动磁珠团。

3.水洗与缓冲液平衡

1）从磁架上取下离心管，加入适量去离子水，轻轻倒置数次；

2）再次放回磁架，待磁珠聚集后，吸除上清；

3）重复水洗2–3次，以充分去除乙醇；

4）使用上样缓冲液（如PBS）以同样方式冲洗2–3次，使磁珠完全平衡在后续上样所需的缓冲体系中。

步骤二：抗体上样（结合阶段）

1.保留原样本对照

1）取少量原始抗体溶液（例如10–20 μL），作为“上样前对照”，用于后续SDS-PAGE比较。

2.加入抗体样品

1）将剩余抗体溶液加入到已经平衡好的磁珠中，轻轻混匀。

3.温和混合孵育

1）将离心管置于旋转或振荡装置上，在室温下温和混匀约30–60分钟，使抗体与Protein A/G/L充分结合。

4.分离结合与未结合部分

1）将离心管放到磁性架上，待磁珠聚集；

2）缓慢吸出上清，作为“流穿（未结合）”部分保存，用于后续分析抗体是否完全捕获。

步骤三：洗涤（去除非特异性蛋白）

1.加入洗涤缓冲液

1）将离心管从磁架上取下，向磁珠中加入上样缓冲液或洗涤缓冲液（常用为PBS）；

2）轻轻倒置或短时间放在低速振荡装置上，使缓冲液充分接触磁珠。

2.磁性分离并去除洗涤液

1）将离心管重新置于磁性架上，待磁珠聚集后吸除洗涤液；

2）将洗涤液保存为“Wash”部分，以便在SDS-PAGE上观察杂蛋白是否仍在洗出。

3.重复洗涤

1）重复上述洗涤步骤2–3次。

2）如发现杂蛋白较多，可在后续实验中适当增加洗涤次数或调整洗涤条件（例如加入少量盐或温和洗涤剂）。

步骤四：洗脱与中和

1.洗脱（低pH或条件改变）

1）从磁架上取下离心管，加入预先配制好的洗脱缓冲液（常见为低pH甘氨酸缓冲液）；

2）轻柔混匀数十秒至数分钟，使低pH条件削弱抗体与Protein A/G/L的结合。

3）再次将离心管置于磁性架上，待磁珠聚集后，吸取洗脱液到新的离心管中，作为“洗脱分级1”。

2.重复洗脱

1）为确保抗体尽可能完全洗脱，可再重复洗脱步骤1–2次，将各次洗脱分别收集或合并。

3.中和

1）由于洗脱缓冲液通常为酸性，为保护抗体结构与活性，需要及时加入高pH、高缓冲容量的中和缓冲液（如高浓度Tris）；

2）中和后溶液pH一般调整至6–8范围。

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