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操作方法

色氨酸紫外吸收光谱定性扫描及定量分析实验

原理

紫外-可见光谱是用紫外-可见光的物质电子光谱，它研究产生于价电子在电子能级间的跃迁，研究物质在紫外-可见光区的分子吸收光谱。当不同波长的单色光通过被分析的物质时能测得不同波长下的吸光度或透光率，以ABS为纵坐标对横坐标波长λ作图，可获得物质的吸收光谱曲线。一般紫外光区为190 ~ 400 nm，可见光区为400 ~ 800 nm。紫外吸收光谱的定性分析为化合物的定性分析提供了信息依据。虽然分子结构各不相同，但只要具有相同的生色团，它们的最大吸收波长值就相同。因此，通过对未知化合物的扫描光谱、最大吸收波长值与已知化合物的标准光谱图在相同溶剂和测量条件下进行比较，就可获得基础鉴定。参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区都无光吸收；在紫外光区只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸具有光吸收能力，其中以色氨酸吸收紫外光的能力最强，色氨酸、酪氨酸最大紫外吸收峰在280 nm。因此，可以根据它们的紫外吸收光谱特征，在紫外-可见光谱分析仪的定性测量模式中通过光谱扫描测量其吸光度-波长的图谱，对它进行准确可靠的定性鉴别。蛋白质在280 nm处有特征性的最大吸收峰是由它所含有的色氨酸和酪氨酸所引起的。利用这一性质可测定蛋白质的含量。

材料与仪器

色氨酸标准溶液 紫外-可见光谱仪

步骤

1．配置20μg·mL-1色氨酸标准溶液。

2．打开紫外-可见光谱仪，初始化仪器，预热5min。

3．定性扫描：在应用菜单中选择定性分析模式，在配置菜单中设置好需要的横坐标（波长值）扫描范围200 ~ 400nm和纵坐标（ABS或％T值）0~ 1ABS记录范围以及扫描。

4．定量分析：定波长扫描。将波长设定，改变分析物的浓度，可得不同的ABS值，据此可达定量测定的目的。

5．不同的仪器型号参照不同的使用说明。

注意事项

1．确定色氨酸在不同波长时的最大波长峰值。

2．固定波长扫描，绘制定量测量的工作曲线，计算未知浓度。

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