Ready-to-Use SABC Kit (Mouse): IHC Staining Protocol
Ready-to-Use SABC Kit (Mouse): IHC Staining Protocol
Ready-to-Use SABC Kit (Mouse) 是一款专为小鼠来源一抗设计的即用型链霉亲和素-生物素复合物免疫组化检测系统，可对组织切片中的靶抗原实现灵敏且特异的检测。
- 试剂盒格式
- 即用型；检测试剂无需手动稀释
- 检测方法
- 链霉亲和素-生物素复合物（SABC）结合DAB显色
- 一抗兼容性
- 小鼠单克隆或多克隆一抗
- 应用
- 适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或冰冻组织切片的免疫组织化学（IHC）检测
- 储存条件
- 4°C保存，冰袋运输
- 货号
- M777864
原理与试剂盒概述
Ready-to-Use SABC Kit（小鼠）采用链霉亲和素-生物素复合物（SABC）法，这是免疫组织化学中灵敏度最高的间接检测系统之一。该方法基于三层结合体系：（1）与靶抗原结合的小鼠来源一抗；（2）针对小鼠免疫球蛋白的生物素化二抗；（3）预先形成的链霉亲和素-生物素-酶复合物，通过高亲和力与生物素化二抗结合。由于链霉亲和素与生物素具有极高的结合亲和力（Kd ~10-15 M），其信号放大效果优于简单的直接法或间接抗体偶联法。
本试剂盒中所有检测试剂均为即用型，无需用户自行滴定，从而有效降低实验间的差异。该试剂盒兼容标准显色底物如DAB（3,3'-二氨基联苯胺），在抗原定位处产生棕色沉淀。
所需材料
以下材料为实验所需，不包含在试剂盒中：
- 针对靶抗原的小鼠来源一抗（用户自备）
- 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或冰冻组织切片，裱于带正电荷的玻璃载玻片上
- 二甲苯及梯度乙醇系列（用于FFPE切片的脱蜡与复水）
- 抗原修复缓冲液（如pH 6.0柠檬酸缓冲液或pH 9.0 EDTA缓冲液）及高压锅或微波炉（根据一抗需求而定）
- 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
- 3%双氧水（H2O2），用于淬灭内源性过氧化物酶
- DAB底物显色试剂盒或溶液
- 苏木精复染液
- 封片剂及盖玻片
- 疏水屏障笔（PAP笔）
- 湿盒
- 光学显微镜
分步染色操作规程
1. 组织切片制备（FFPE）
- 切取4–6 µm厚度切片并裱于带正电荷的载玻片上，60°C烘烤1小时。
- 二甲苯脱蜡（2×10分钟），依次经100%、95%、70%乙醇复水（每步5分钟），蒸馏水漂洗。
2. 抗原修复（如需要）
- 将载玻片浸入适当的修复缓冲液，使用高压锅或微波炉按已验证方案进行热修复，修复完成后冷却至室温再进行下一步。
3. 淬灭内源性过氧化物酶
- 在室温下，将切片置于PBS配制的3% H2O2溶液中孵育10分钟，PBS洗涤3×5分钟。
4. 封闭
- 在切片上滴加试剂盒提供的封闭液，室温孵育10–20分钟以降低非特异性背景，无需洗涤，甩去多余液体。
5. 一抗孵育
- 滴加适当稀释的小鼠来源一抗，于湿盒中4°C过夜孵育或37°C孵育1–2小时，PBS洗涤3×5分钟。
6. 生物素化二抗
- 滴加试剂盒提供的即用型生物素化抗小鼠二抗，37°C孵育20–30分钟，PBS洗涤3×5分钟。
7. SABC试剂孵育
- 滴加即用型链霉亲和素-生物素-HRP复合物试剂，37°C孵育20–30分钟，PBS洗涤3×5分钟。
8. DAB显色
- 滴加新鲜配制的DAB底物溶液，在显微镜下监控显色（通常3–10分钟），蒸馏水漂洗终止反应。
9. 复染与封片
- 苏木精复染1–3分钟，漂洗后依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，用永久封片剂封盖盖玻片。
故障排除指南
| 问题 | 可能原因 | 建议处理措施 |
|---|---|---|
| 无染色或信号弱 | 抗原修复不充分；一抗浓度过低；SABC孵育时间不足 | 优化抗原修复方法和缓冲液；滴定一抗浓度；延长孵育时间 |
| 背景过高 | 封闭不充分；一抗浓度过高；洗涤不彻底 | 延长封闭时间；降低一抗浓度；增加洗涤强度和次数 |
| 非特异性染色 | 组织中存在内源性生物素活性（尤其是肝脏、肾脏、脑组织） | 在一抗孵育前加入亲和素/生物素封闭步骤 |
| 染色不均匀 | 孵育过程中切片干燥；试剂涂布不均 | 确保使用湿盒；均匀涂布试剂；使用PAP笔划疏水圈 |
| 阳性对照失败 | 试剂降解；冷链中断 | 确认4°C保存；检查有效期；更换新鲜试剂重新实验 |
储存、操作与安全
储存：整套试剂盒应在4°C保存，切勿冷冻。试剂盒采用冰袋运输以维持运输过程中的冷链。避免任何组分反复冻融。
操作：使用前将所有试剂恢复至室温。轻柔混匀，切勿涡旋振荡。每种试剂使用干净的一次性吸头以防交叉污染。DAB底物应在每次使用前新鲜配制，因其对光敏感且不稳定。
安全：DAB（3,3'-二氨基联苯胺）为疑似致癌物，操作含DAB的溶液时须佩戴适当的个人防护装备（实验服、丁腈手套、护目镜），并依照所在机构及监管法规要求处置DAB废液。使用前请查阅所有试剂盒组分的安全数据表（SDS）。
常见问题
本试剂盒是否可用于兔来源的一抗？
不可以。本试剂盒专为小鼠来源一抗设计，试剂盒中的生物素化二抗是针对小鼠免疫球蛋白制备的，无法用于兔或其他物种来源一抗的可靠检测。若需使用兔来源一抗，请选用专为兔一抗设计的SABC试剂盒。
如何处理组织中的内源性生物素干扰？
富含内源性生物素的组织（如肝脏、肾脏、肾上腺和脑组织）在使用生物素检测体系时可能产生假阳性背景。建议在一抗孵育前进行亲和素/生物素封闭步骤，可使用市售亲和素/生物素封闭试剂盒，按其说明书依次操作。
试剂盒的推荐储存条件和有效期是多少？
Ready-to-Use SABC Kit（小鼠）应在4°C保存，切勿冷冻，以冰袋运输以保障试剂活性。有效期请参见试剂盒包装上标注的日期。维持完整的冷链对于保证试剂盒最佳性能至关重要。
检测试剂使用前是否需要稀释？
不需要。本试剂盒中所有检测试剂（包括生物素化二抗和链霉亲和素-生物素-HRP复合物）均为即用型，无需稀释。仅用户自备的一抗需由实验者自行优化和滴定。
本试剂盒是否同时适用于冰冻切片和FFPE切片？
是的，本试剂盒兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片和冰冻切片。冰冻切片通常无需脱蜡和抗原修复步骤，但根据靶抗原及所用一抗的不同，可能需要用冷丙酮或4%多聚甲醛进行固定。
参考文献
- Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1981;29(4):577-580.
- Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1991;39(6):741-748.
- Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1981;29(10):1196-1204.
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