实验方案（Protocols）

重组人CDC34蛋白：操作与使用实验方案

· · 发布于 2026年10月30日 · 更新于 2026年10月30日 ·

Recombinant Human CDC34 Protein是一种真核E2泛素结合酶，在SCF复合物介导的蛋白质泛素化及蛋白酶体降解过程中发挥关键作用，是研究细胞周期调控和泛素通路生物学的重要试剂。

产品名称: 重组人CDC34蛋白
货号: rp377104
蛋白功能: E2泛素结合酶；接受E1转移的泛素并通过SCF复合物将其转移至底物蛋白
别名: UBE2R1；CDC34A；E2-CDC34
推荐储存条件: 于-80 °C储存；避免反复冻融；首次使用时分装
复溶缓冲液: 无菌PBS或20 mM Tris-HCl（pH 7.5）含10%甘油；具体缓冲液以质量检验报告为准
供应商: Aladdin Scientific（absea编号：PP-10614）

所需材料与设备

开始操作前，请准备以下材料：

重组人CDC34蛋白（货号：rp377104；absea编号：PP-10614）
复溶缓冲液：无菌无核酸酶PBS（pH 7.4）或20 mM Tris-HCl（pH 7.5）含10%（v/v）甘油——请参阅具体批次质量检验报告（CoA）以确认推荐缓冲液
微量离心管（1.5 mL，低蛋白吸附）
经校准的微量移液器及无菌滤芯吸头
可达≥10,000 × g的微型离心机
冰桶或冷却模块
-80 °C冰箱（长期储存）；-20 °C冰箱（短期储存，≤1个月）
SDS-PAGE凝胶系统及考马斯亮蓝或银染试剂（用于纯度验证）
蛋白质印迹（Western blot）装置及抗CDC34或抗His/GST标签抗体（如含标签）
泛素化检测试剂盒或组件：E1激活酶、泛素、ATP/Mg²⁺反应缓冲液（用于活性验证）

注意：所有操作应在冰上或4 °C条件下进行，以维持酶的完整性。

复溶与储存操作步骤

请按以下步骤安全复溶并储存重组人CDC34蛋白：

谨慎解冻：将冻存管从-80 °C储存处取出，在冰上解冻10–15分钟。勿在室温解冻或使用高于4 °C的水浴。
离心：以2,000–3,000 × g短暂离心30秒，使冻干物料或管壁冷凝液沉积于管底。
加入复溶缓冲液：用经校准的微量移液器沿管壁缓慢加入适量预冷复溶缓冲液（用量参见CoA），以避免起泡。轻柔旋转或吸打混匀；切勿涡旋振荡。
平衡：将复溶液在冰上静置5–10分钟，期间间歇轻柔混匀，确保完全溶解。
立即分装：将蛋白液分装至低蛋白吸附微量离心管中，每管为单次用量，以避免反复冻融导致E2酶活性下降。
速冻：在液氮或干冰/乙醇浴中将分装管速冻后，转至-80 °C长期储存。
工作液：若一周内频繁使用，可将分装液储存于4 °C，并加入终浓度1 mM的DTT作为还原剂，保护活性位点半胱氨酸残基。

稳定性：正确储存的分装液预计在-80 °C条件下可维持活性长达12个月，具体应以该批次CoA为准。

SDS-PAGE与Western Blot质量验证

在进行下游检测前，请按以下方法验证蛋白质的身份、纯度和完整性：

SDS-PAGE纯度检测

制备还原性SDS-PAGE样品：将1–2 µg复溶CDC34蛋白与含β-巯基乙醇的4× Laemmli上样缓冲液混合，于95 °C加热5分钟。
与预染分子量标准品一同上样至12–15%聚丙烯酰胺凝胶。
在100–120 V电压下电泳，直至染料前沿跑至凝胶底部。
用考马斯亮蓝R-250或银染液染色，脱色后成像。
预期结果：在CDC34预测分子量处出现主带（UBC结构域约23–26 kDa；全长人CDC34/UBE2R1约28–35 kDa，因亚型和标签而异）。具体预期分子量请参阅CoA。

Western Blot确认

将凝胶中蛋白转印至PVDF或硝酸纤维素膜。
用含5%脱脂奶粉的TBST在室温封闭1小时。
按抗体厂商推荐稀释比例加入抗CDC34一抗或抗亲和标签抗体（如抗His），于4 °C孵育过夜。
用TBST洗涤3次，室温孵育HRP标记二抗1小时。
用ECL底物显色并成像。

验收标准：建议以凝胶扫描密度法检测纯度≥90%，且Western blot在预期分子量处出现单一特异性条带，方可进行功能检测。

功能性泛素化活性检测

CDC34（UBE2R1）在泛素-蛋白酶体通路中作为E2泛素结合酶发挥功能。使用以下体外泛素化检测方法确认其酶学活性：

反应组分

E1泛素激活酶（市售）
泛素（人源重组蛋白）
重组人CDC34蛋白（rp377104）——E2酶
SCF E3连接酶复合物或RING结构域E3连接酶（根据底物选择）
目的底物蛋白（如p27^Kip1、IκBα——已验证的CDC34底物）
反应缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl₂、2 mM ATP、0.1 mM DTT

检测步骤

在冰上于20–30 µL总体积中组装反应体系：依次加入反应缓冲液、E1（50–100 nM）、泛素（2–5 µM）、CDC34/E2（200–500 nM）、E3连接酶及底物，各组分用量参照相应CoA或文献推荐。
将离心管转移至37 °C启动反应，孵育60–120分钟。
加入4× 还原性SDS-PAGE上样缓冲液并于95 °C加热5分钟终止反应。
SDS-PAGE分离后，用抗底物或抗泛素抗体通过Western blot检测泛素化底物。
预期结果：在未修饰底物条带上方出现高分子量多泛素化梯形条带，表明E2介导的泛素转移成功。

阳性和阴性对照：设置无CDC34对照组（以缓冲液代替）和无ATP对照组以确认反应特异性，亦可设置经验证E2酶的阳性对照。

注意：特定检测参数（酶浓度、孵育时间）可能需要针对各实验体系进行优化。具体工作浓度应以产品CoA及相关文献为准。

问题排查与最佳操作规范

参阅下表诊断并解决使用重组人CDC34蛋白时常见的问题：

问题	可能原因	建议措施
SDS-PAGE条带缺失或偏弱	上样量不足；复溶不完全	用BCA或Bradford法测定蛋白浓度；确保完全复溶；增加上样体积
出现多条带/降解	反复冻融；蛋白酶污染；储存不当	使用新鲜分装液；复溶缓冲液中加入蛋白酶抑制剂混合物；于-80 °C储存
无泛素化活性	冻融损伤导致E2失活；活性位点Cys氧化；检测组分缺失	在反应体系中加入1–5 mM DTT；使用新鲜分装液；单独验证E1活性；检查ATP浓度及pH值
Western blot背景偏高	过度封闭；抗体交叉反应；上样量过多	优化抗体稀释比例；减少上样量；洗膜缓冲液中使用0.1% Tween-20
蛋白聚集/沉淀	浓度过高；缓冲液不适；冻融	保存于冰上；临用前稀释至工作浓度；储存缓冲液中加入0.01–0.05% Tween-20或150 mM NaCl

通用最佳操作规范：

始终在冰上操作；尽量缩短在室温下的暴露时间。
工作缓冲液中使用还原剂（DTT或TCEP）以保护CDC34的催化半胱氨酸。
每次使用新分装液前，用比色法蛋白定量检测蛋白浓度。
每次实验均记录批号和CoA信息，确保实验可重复性。
按照所在机构生物安全规定妥善处置蛋白废弃物。

常见问题

重组人CDC34蛋白的推荐复溶缓冲液是什么？

通常推荐使用无菌PBS（pH 7.4）或含10%甘油的20 mM Tris-HCl（pH 7.5）进行复溶。但每批次的具体复溶缓冲液和用量应以产品随附的质量检验报告（absea编号：PP-10614 / 货号rp377104）为准，因配方可能因批次不同而有所差异。

重组人CDC34蛋白能耐受多少次冻融循环？

作为含有活性位点半胱氨酸的E2泛素结合酶，CDC34对反复冻融敏感，多次冻融可导致氧化和聚集，进而丧失活性。强烈建议首次解冻后立即分装为单次用量，每管分装液避免超过一次冻融循环。具体批次的稳定性数据请参阅产品CoA。

CDC34泛素化活性检测中应设置哪些阳性和阴性对照？

无E2对照组（以等体积缓冲液替换CDC34）和无ATP对照组是必要的阴性对照，用于确认泛素化梯形条带的形成依赖于E2酶和能量。设置已验证E2酶（已知活性）的阳性对照，或使用商品化试剂盒中预组装的泛素化反应体系，有助于确认E1、E3、泛素及底物组分均功能正常。

在使用CDC34蛋白时，DTT为何至关重要？

CDC34是一种E2泛素结合酶，在泛素转移反应中其催化半胱氨酸残基与泛素形成硫酯键。该活性位点半胱氨酸易被氧化，导致酶不可逆失活。在储存液和反应缓冲液中加入还原剂（如1–5 mM DTT或TCEP），有助于维持半胱氨酸的还原态及其催化活性。

CDC34/SCF E3连接酶系统的已知底物有哪些？

CDC34（UBE2R1）与SCF（Skp1–Cullin1–F-box蛋白）E3连接酶复合物协同作用，泛素化修饰细胞周期调控蛋白。已充分验证的底物包括：p27Kip1（由SCF-Skp2靶向）、IκBα（由SCF-β-TrCP靶向）和细胞周期蛋白E（由SCF-Fbxw7靶向）。SCF复合物中特定的F-box蛋白决定底物的选择性。

参考文献

Deshaies RJ, Joazeiro CA. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annu Rev Biochem. 2009;78:399-434. doi:10.1146/annurev.biochem.78.101807.093809
Petroski MD, Deshaies RJ. Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6(1):9-20. doi:10.1038/nrm1547
Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 1998;67:425-479. doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.425
Aladdin Scientific. Recombinant Human CDC34 Protein, SKU rp377104 (absea #PP-10614). Product datasheet.

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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探索主题：重组蛋白实验方案 CDC34 泛素结合酶 E2酶

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。