所需溶液：TRIZOL试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（在DEPC处理水中）、无核糖核酸酶水

协议

1.均匀化

• 组织-使用玻璃-聚四氟乙烯或电动均质器，每50-100 mg组织在1 mL TRIZOL试剂中均质组织样本。

• 粘附细胞-通过向直径为3.5 cm的培养皿中添加1 mL TRIZOL试剂，并将细胞裂解液通过移液管数次，直接在培养皿中裂解细胞。TRIZOL试剂的添加量取决于培养皿的面积（每10厘米2 1毫升），而不是存在的细胞数量。注：TRIZOL试剂用量不足可能导致分离的RNA被DNA污染。

• 悬浮细胞-通过离心的颗粒细胞。通过重复移液在TRIZOL试剂中溶解细胞。每5-10×106个动物、植物或酵母细胞或每1×107个细菌细胞使用1 mL试剂。

2.相位分离

• 在室温（RT）下将均质样品培养5分钟，以使核蛋白复合物完全解离。

• 每1ml TRIZOL试剂添加0.2ml氯仿。用手用力摇晃试管15秒，并在室温下培养2到3分钟。

• 在4°C下，在不超过12000×g的条件下离心样品15分钟。（混合物分为低酚-氯仿相、中间相和无色上水相。RNA保留在水相中。）

3.RNA沉淀

• 将水相转移到新管中。

• 通过与异丙醇（每1ml TRIZOL试剂0.5ml异丙醇）混合沉淀RNA。

• 在室温下培养样品10分钟。

• 在4°C下，在不超过12000×g的条件下离心10分钟。RNA沉淀将在试管的侧面和底部形成凝胶状颗粒。

4.洗涤RNA

• 去除上清液。dd-每1ml TRIZOL试剂至少1ml 75%乙醇，以清洗RNA颗粒。

• 通过涡流和离心在不超过7500×g的条件下在4°C下混合样品5分钟。

• 在-80°C下与乙醇一起储存，或重新溶解以供使用。

5.重新溶解RNA

• 去除上清液并短暂干燥RNA颗粒。不要让RNA颗粒完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。

• 翻转试管几次，将RNA溶解在无核糖核酸酶的水中，并在55至60°C下培养10分钟。