一、实验原理与适用范围

1.1实验原理

RNA pull-down通过生物素标记的诱饵RNA与样本蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白复合物；随后利用生物素-链霉亲和素体系将复合物富集到链霉亲和素磁珠或琼脂糖上，经多步洗涤去除非特异结合后，回收蛋白进行SDS-PAGE/Western Blot或质谱分析，从而鉴定与特定RNA结合的蛋白质。

1.2适用研究问题

（1）筛选与mRNA、lncRNA、circRNA、病毒RNA等结合的蛋白质；

（2）验证候选RNA结合蛋白是否与目标RNA存在物理互作；

（3）比较不同处理条件下RNA-蛋白互作谱差异；

（4）为后续RIP、CLIP及功能干预实验提供候选互作蛋白清单。

二、试剂与材料

2.1样本类型与用量

（1）细胞样本

①建议总细胞数≥1×10⁷(可根据目标RNA表达丰度适当上调)；

②细胞状态良好，无污染，无明显凋亡坏死。

（2）组织样本

①新鲜或妥善冷冻保存的动物组织，一般不少于0.5 g；

②取材后尽快低温保存，避免反复冻融。

2.2主要试剂

（1）RNA诱饵

①体外转录获得的目标RNA(全长或功能区片段，部分NTP替换为生物素-NTP)；

②或化学合成的短RNA探针(一般≤60 nt)，在5'或3'端进行生物素标记。

（2）亲和富集相关试剂

①链霉亲和素磁珠或链霉亲和素琼脂糖；

②RNase抑制剂；

③蛋白酶抑制剂(如PMSF或复合抑制剂)。

（3）缓冲液(典型配置，可按体系优化)

①裂解缓冲液:Tris-HCl，pH7.5–8.0，含适量NaCl、MgCl₂和非离子型去污剂(如NP-40)，现用前加入蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂；

②孵育缓冲液:以裂解缓冲液为基础，适当调整盐度和去污剂浓度；

③洗涤缓冲液:与孵育缓冲液相近或略高盐度，必要时略增去污剂浓度以降低非特异结合；

④洗脱液:SDS上样缓冲液(用于Western Blot)或高盐/竞争RNA缓冲液(用于质谱)。

（4）其他试剂

①DEPC处理水或RNase-free水；

②SDS-PAGE及Western Blot配套试剂；

③若进行质谱分析:蛋白沉淀及脱盐相关试剂。

2.3仪器与耗材

（1）低温离心机(4 ℃)；

（2）超声破碎仪或组织匀浆器；

（3）恒温混匀仪或旋转混匀器；

（4）磁力架；

（5）电泳、转膜及成像系统或质谱平台；

（6）RNase-free枪头、EP管、离心管、冰盒等。

三、RNA诱饵制备与质控

3.1体外转录制备生物素标记RNA(推荐)

（1）模板构建

①在目标序列正向引物5'端添加T7启动子序列；

②PCR扩增获得带T7启动子的DNA模板。

（2）体外转录反应

①按试剂盒说明配置含NTP(部分为生物素-NTP)的反应体系；

②37 ℃孵育1–2 h，保证充分转录。

（3）RNA纯化与定量

①按体系加入DNase I消化去除DNA模板（多数体外转录试剂盒在转录后提供DNase步骤），随后再进行柱纯化或酚/氯仿抽提与沉淀/脱盐，以获得不含模板DNA的RNA。

②检测OD260/280并进行琼脂糖凝胶电泳评估完整性；

③体外转录RNA的产量与浓度因模板长度、序列与体系差异较大；建议以定量结果为准，并确保单次反应可提供满足每管1–5 μg（长RNA）或10–100 pmol（短探针）的用量需求。

3.2短片段RNA探针合成

（1）适用于长度≤60 nt的诱饵片段，可直接合成带生物素标记的RNA；

（2）设计时尽量避开强二级结构区域，提高序列特异性，降低非特异结合风险。

3.3RNA诱饵质控

（1）通过琼脂糖凝胶或变性PAGE检查条带完整性与纯度；

（2）必要时比较生物素标记RNA与未标记RNA的迁移情况；

（3）pull-down中一般使用过量RNA，关键是同一批实验内用量保持一致。

四、蛋白样本制备

4.1裂解步骤

（1）细胞样本

①用PBS轻柔冲洗细胞1–2次去除培养基；

②加入预冷裂解缓冲液，吹打或轻涡旋重悬；

③冰上裂解20–30 min。

（2）组织样本

①PBS冲洗除去血液等杂质；

②加入裂解缓冲液后机械匀浆或在液氮中研磨成粉末；

③冰上继续裂解。

4.2超声破碎与澄清

（1）冰浴超声破碎

①建议采用“工作2–3 s/间歇3 s”循环；

②细胞样本总时间约1–2 min，组织样本可延长至3–5 min；

③避免明显起泡和温度升高。

（2）离心澄清

①4 ℃，12000 r/min离心10–15 min；

②取上清作为蛋白裂解液(总蛋白)。

4.3样本保护与保存

（1）裂解液中现用前加入蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂；

（2）短期置4 ℃，长期分装置-80 ℃保存，避免反复冻融；

（3）可先行SDS-PAGE或考染评估裂解效果与蛋白完整性。

五、RNA pull-down实验步骤

5.1磁珠预处理与平衡

（1）自4 ℃冰箱取出链霉亲和素磁珠，轻柔混匀；

（2）按每反应体系分装磁珠(如30 μL/管)，置磁力架上静置1 min，弃上清；

（3）加入预冷平衡缓冲液重悬，洗涤2–3次；

（4）最后用孵育缓冲液重悬，调整体积备用。

5.2RNA与磁珠结合

（1）向预处理磁珠中加入生物素标记RNA：短寡核苷酸（≤60 nt）可按10–100 pmol优化；较长体外转录RNA更建议按质量计（如1–5 μg，必要时上调）；

（2）用孵育缓冲液补足至200–500 μL，轻柔混匀；

（3）室温旋转或轻摇孵育1–2 h；

（4）磁分离，弃上清，用孵育缓冲液洗涤2–3次；

（5）得到RNA-磁珠复合物。

建议设置对照组:

①生物素标记目标RNA组(实验组)；

②同样带生物素标记的无关序列RNA（scramble）或结合位点突变RNA组（阴性对照）；

③仅磁珠不加RNA组(背景对照)。

5.3RNA-蛋白孵育

（1）将RNA-磁珠复合物重悬于孵育缓冲液中(约200–500 μL)；

（2）加入300–2000 μg蛋白裂解液；

（3）补加RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂；

（4）另取部分裂解液保存作为Input对照；

（5）4 ℃下旋转或轻摇孵育4 h至过夜(12–16 h)。

5.4洗涤

（1）孵育结束后置磁力架分离磁珠，必要时保留上清备用；

（2）加入预冷洗涤缓冲液重悬磁珠，轻摇3–5 min；

（3）磁分离，弃上清；

（4）重复洗涤3–5次，可根据背景情况适度提高盐浓度或去污剂浓度。

5.5蛋白洗脱与样品制备

（1）用于Western Blot的洗脱

①向磁珠中加入1×或2×SDS上样缓冲液；

②95–100 ℃加热5–10 min；

③磁分离或短暂离心，收集上清作为pull-down样品；

④Input样品同样加入上样缓冲液煮沸。

（2）用于质谱的洗脱

①采用高盐或竞争RNA温和洗脱，避免SDS干扰；

②洗脱液经丙酮或TCA沉淀后转入质谱兼容缓冲液；

③也可先SDS-PAGE分离后银染，按条带位置切胶送质谱。

六、结果检测与数据判读

6.1Western Blot检测

（1）将Input、实验组和对照组pull-down样品进行SDS-PAGE电泳；

（2）转膜后孵育针对候选RNA结合蛋白的一抗及相应二抗；

（3）判读原则:

①实验组出现清晰特异条带而对照组无条带，提示存在较为特异的RNA-蛋白互作；

②实验组与对照组均有条带，提示非特异结合偏高，需优化孵育与洗涤条件；

③Input有条带而pull-down无信号，需检查蛋白表达量、抗体性能以及诱饵与孵育条件。

6.2质谱分析

（1）对pull-down洗脱产物进行银染或考染，评估蛋白丰度与复杂度；

（2）经LC-MS/MS鉴定蛋白组成；

（3）结合对照组数据剔除背景蛋白，保留特异富集蛋白；

（4）根据特征肽段数、覆盖度及功能注释筛选后续重点研究对象。

七、常见问题与解决策略

7.1RNA降解

（1）所有试剂和耗材尽可能使用RNase-free级别；仅对“纯水/不含胺类缓冲组分的溶液”可采用DEPC处理；含Tris等缓冲液建议直接使用RNase-free配制或购买的成品缓冲液；

（2）操作全程佩戴手套，减少裸露皮肤接触；

（3）裂解、孵育和洗涤步骤尽量在冰上完成；

（4）裂解液与孵育体系中加入足量RNase抑制剂。

7.2RNA来源与策略选择

（1）体外转录适合较长RNA，纯度和特异性较好，为pull-down首选；

（2）短探针策略适合≤60 nt片段，但非特异结合风险相对更大；

（3）当目标RNA长度>2000 nt且体外转录困难时，可改为：

①体外转录功能区片段作为诱饵；

②采用生物素化反义寡核苷酸捕获内源RNA并富集其结合蛋白。

7.3蛋白结合量低或无明显条带

（1）确保蛋白活性:使用新鲜裂解液，全程低温并加入蛋白酶抑制剂；

（2）优化孵育时间与温度:优先4 ℃旋转过夜，强互作可尝试较短时间室温孵育；

（3）增加RNA或蛋白用量，保证诱饵相对过量；

（4）必要时在细胞或组织中预先过表达目标蛋白。

7.4背景高、非特异条带多

（1）适度提高洗涤缓冲液盐浓度，或略增去污剂浓度；

（2）加入非特异竞争RNA(如tRNA)或非特异蛋白/多肽减少非特异吸附；