逆转录反应

1.在进行RT反应之前，在65°C下以10微升体积加热5微克总RNA 5-10分钟，然后在冰上淬火。

2.在1.5 mL Eppendorf管中设置以下组件：

• 10.0 uL热变性RNA

• 3.0 uL 10x PCR缓冲液

• 2.5 uL 10 mM dNTPs

• 6.0 uL 25 mM MgCI2

• 1.0 uL随机引物（1.8mg/mL）

• 0.5 uL SuperScript II逆转录酶

• 17.0微升水

      警告：不能使用DEPC处理过的水进行RT反应，因为DEPC会抑制RT和PCR反应！

3.将样品置于25°C下10分钟，然后在42°C下培养1小时。

4.95℃变性cDNA并放在冰上。

PCR反应

1.在0.5 mL PCR管中设置以下成分：

• 6.0 uL cDNA产物

• 1.5 uL 10x PCR缓冲液

• 0.2微升Taq聚合酶

• 0.5 uL底漆1（1.0mg/mL）

• 0.5 uL底漆2（1.0mg/mL）

• 10.3微升水

2、进行30个周期的PCR。每个循环包括变性（95°C下30秒）；退火（60°C下45秒）；和延长（72°C时60秒）。