外周血样本采集完毕后，我们需要对其中的待测单细胞进行提取。针对外周血样本，最常使用的样本制备方法有两种：

一. 裂红法

        利用红细胞裂解液，去除红细胞

二. Ficoll法

        利用不同细胞的沉降系数差异，进行梯度密度离心，提取PBMC

裂红法

        裂红法，即裂解样本中的红细胞。血液中的红细胞比白细胞多10-100倍，红细胞数量过多，会影响细胞群体的分析。因此，我们在做血液样本检测时，经常需要裂解红细胞。

裂红前

裂红后

01 原理

        通过改变细胞外环境的渗透压和离子浓度来破坏红细胞的结构。红细胞裂解液中的化学物质通常包括一种或多种溶解酶，如血红蛋白酶。这些酶能够与红细胞膜上的特定蛋白质结合，从而溶解红细胞膜，使细胞内部的内容物得以释放。

02 优点

        ⊙ 各类型白细胞（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等）保存完整

        ⊙ 得率高

        ⊙ 步骤简单，10min即可

03 缺点

        ⊙ 对裂红时间要求较高，过长或过短均会影响结果

        ⊙ 细胞活性低于Ficoll法

04 使用注意事项

        ⊙ 裂解时间过长，也会对其它细胞造成损伤，所以要把握好裂解的时间；

        ⊙ 做流式检测时，并非所有的血液样本都需要裂红。倘若需要检测的是白细胞（如淋巴、单核、粒细胞等），需要裂解红细胞；倘若检测的是红细胞，不需要裂解红细胞；

        ⊙ 如果后续样本不用于流式分析，而是需要培养或者冻存复苏，使用裂红后培养的细胞，活性可能会打折扣。

        目前市面上的红细胞裂解液有两种：含有固定剂；不含有固定剂。不含固定剂的红细胞裂解液作用较为温和；含有固定剂的红细胞裂解液作用较为强烈，但是裂红效果相对更好。

        使用含固定剂的红细胞裂解液要注意：

        a. 固定剂可能会降低抗体的荧光信号强度，特别是串联染料；

        b. 同时，如果在染色前对细胞进行了固定，抗原表位可能会因为固定被破坏，导致抗体无法识别。

Ficoll 密度梯度离心法

01 原理

        根据细胞的沉降系数差异，借助细胞分离液和离心操作，对细胞进行分离。

02 优点

        ⊙ 获得的细胞更纯净，有利于细胞培养后检测胞内因子

        ⊙ 可将细胞冻存后再复苏、培养、检测

        ⊙ 去除死细胞

03 缺点

        ⊙ 步骤复杂，需30min以上

        ⊙ 取白膜层需要丰富的经验

        ⊙ 只能获得淋巴细胞和单核细胞，会丢失一部分稀有细胞

        ⊙ 可能会引起细胞受体激活

分离前

分离后

总 结

        • 如研究对象是淋巴细胞、单核细胞或粒细胞，且细胞不需要进行培养或冻存，仅进行流式分析时，建议使用裂红法制备外周血样本；

        • 如研究对象是淋巴细胞亚群或单核细胞，在做以下实验时，建议使用Ficoll法提取PBMC：

     （1）获得的细胞需要继续培养、刺激、阻断或冻存；

     （2）研究单核细胞。因为单核细胞只占白细胞的3-10%，如果使用裂红法，会发现细胞群体太少。为了保证充足的样本量，需要使用Ficoll法。

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