前列腺原位肿瘤模型的建立可以：（1）连续活体监测前列腺癌发生、发展；（2）用于前列腺原位肿瘤生长及治疗的研究；（3）研究前列腺癌的生物学行为。

操作方法

原位种植法

原理

10只BALB/C裸鼠前列腺背侧包膜内注入携带红色荧光蛋白（RFP）的前列腺癌PC-3细胞（PR7细胞）悬液20μL，第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统观察前列腺原位肿瘤发生及其转移情况。尸检取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结等组织，制成冰冻切片，通过荧光显微镜下观察及HE染色等方法分别检测肿瘤发生及有无转移等情况。

材料与仪器

BALB C裸鼠 前列腺癌PR7细胞系
饲料 饮用水 胰酶 EDTA Hank平衡盐溶液 水合氯醛 多聚甲醛 苏木素-伊红
孵箱 倒置荧光显微镜 冻存管 棉签 针头 光学显微镜 注射器 非侵入式活体分子影像系统

步骤

一、实验材料准备

1.  雄性BALB/C裸鼠10只，6周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养SPF条件下超净层流架内，饲料及饮水自由摄入。   2.  稳定表达红色荧光蛋白（前列腺癌PR7细胞系）用含5%胎牛血清（体积分数）（杭州四季青生物工程有限公司）的RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）在37、5% CO₂（体积分数）孵箱内培养，0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（体积分数）消化及传代。

二、RFP表达情况
  倒置荧光显微镜下观察前列腺癌PC-3及PR7细胞RFP表达情况。  三、前列腺原位肿瘤模型的建立
  1.  对数生长期PR7细胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（体积分数）消化，Hank平衡盐溶液（HBSS）洗涤离心后重悬制备2×10⁷/mL细胞悬液，移入无菌细胞冻存管带至实验动物中心备用。

2.  裸鼠用10%水合氯醛（体积分数）（4 mL/mg）腹腔注射麻醉后固定，碘伏消毒皮肤后取下腹正中纵切口1 cm，暴露膀胱及精囊腺，棉签辅助充分暴露前列腺。

3.  一次性1 mL胰岛素注射器29G针头斜面向上小心刺入前列腺包膜内，缓慢注入上述细胞悬液20 μL，可见前列腺包膜明显鼓起且无外渗，退出针头，恢复脏器解剖位置，7-0可吸收缝线间断缝合肌层，4-0丝线缝合皮肤。

4.  待裸鼠苏醒后回笼。  五、非侵入式活体分子影像系统监测原位肿瘤及转移情况   术后第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统（美国Xenogen公司）监测原位肿瘤形成、生长及转移情况。
 六、病理检查   1.  术后6～8周，所有裸鼠均出现恶液质。

2.  颈椎脱臼法处死，取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结。

3.  分别做冰冻切片各2张，切片厚度为10 μm。

4.  各组织分别取1张滴加DAPI（4′，6－二脒基－２－苯基吲哚）染色2 min，用PBS洗3次、每次3 min。

5.  荧光显微镜下观察，绿光激发红光，紫外光激发蓝光。

6.  以原位肿瘤为阳性对照。

7.  另1张用4%多聚甲醛固定10 min后苏木素－伊红（HE）染色，普通光镜下寻找转移灶。

常见问题

一、实验讨论

随着荧光蛋白的发现及其在生物医学领域的广泛应用和动物活体荧光成像技术的发展，在不处死动物的情况下动态观察原发肿瘤的形成、生长及转移发生的情况成为可能。应用于标记肿瘤细胞的荧光蛋白主要有RFP和绿色荧光蛋白（green　fluorecent protein）。RFP与GFP相比，激发和发射波长较长，且其发射峰位于培养基、培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比和灵敏度；而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。故本实验选用RFP标记的前列腺癌PR7细胞原位接种于前列腺包膜内，然后用非侵入式活体分子影像系统连续活体观察荧光信号及其强度的变化来监测原位肿瘤的形成、生长及转移过程。

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