实验方案（Protocols）

蛋白质Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶电泳系统标准操作规程

· · 发布于 2025年11月7日 · 更新于 2025年11月7日 ·

1.实验器材

Ø量具与玻璃器皿：量筒（100 mL、500 mL、1000 mL）、容量瓶（100 mL）、烧杯、玻璃棒

Ø储存与取样容器：广口试剂瓶（500 mL、1000 mL）、棕色瓶（250 mL、500 mL）、离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）、棕色离心管（用于分装TEMED）、保鲜膜/密封袋

Ø电泳与制胶组件：垂直电泳系统（含电源、电泳槽等配套设施）、制胶玻璃板（厚板0.75/1/1.5 mm的spacer plate与薄板short plate）及塑料框架

Ø移液工具：微量移液器与配套吸头（10 μL、200 μL、1 mL、5 mL）

Ø过滤与清洁耗材：滤纸、无尘擦拭纸

Ø测量/仪器设备：pH计、分析天平、涡旋混匀仪

2.实验试剂

Ø32%丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺混合液（Acr-Bis）

组分	用量	1X终浓度或百分比
丙烯酰胺（MW：71.08）	30 g	30%
甲叉双丙烯酰胺（MW：154.17）	2 g	2%
ddH₂O	定容至100 ml

配制方法（100ml）

①于100 mL烧杯中称取丙烯酰胺（Acr）30.00 g与N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）2.00 g。

②加入超纯水50 mL，磁力搅拌至完全溶解。

③将溶液转入100 mL量筒，以超纯水定容至100.0 mL，轻轻倒混使其均一。

④以滤纸（或0.45 μm滤膜）过滤后转入棕色试剂瓶，避光，4℃储存；建议在1–2个月内使用。

Ø3.5×Bis-Tris胶缓冲液

组分	用量	1X终浓度或百分比
Bis-Tris（MW：209.24）	2.616 g	35 mM
ddH₂O	定容至100 ml

配制方法（100ml）

①称取Bis-Tris 2.616 g于100 mL烧杯。

②加入去离子水50 mL，磁力搅拌至完全溶解。

③以浓盐酸逐滴调节至pH 6.5–6.8，并实时监测pH。

④将溶液转入100 mL量筒，以去离子水定容至100.0 mL；过滤后分装密封，4℃贮存。

Ø10%过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED）

Ø电泳缓冲液（20×MES Running Buffer，20×MOPS Running Buffer）

（1）20×MES电泳缓冲液（适用于低于20 kDa的蛋白）配方

组分	用量	1X终浓度或百分比
MES-H2O（MW：213.25）	213 g	50 mM
Tris（MW：121.14）	121.14 g	50 mM
EDTA-2Na-2H2O（MW：372.24）	7.44 g	1 mM
SDS（MW：288.38）	20 g	0.1%
ddH₂O	定容至1000 ml

pH7.3

配制方法(1000ml)

①将下列组分依次称量并加入1000 mL烧杯：MES·H₂O 213.0 g、Tris 121.14 g、EDTA·2Na·2H₂O 7.44 g、SDS 20.00 g。

②加入去离子水600 mL，磁力搅拌至各组分完全溶解。

③将溶液转移至1000 mL量筒，以去离子水定容至1000 mL；无需调节pH。

④分装密封，于4℃贮存。

（2）20×MOPS电泳缓冲液（适用于大于20 kDa的蛋白）配方

组分	用量	1X终浓度或百分比
MOPS（MW：209.26）	209.26 g	50 mM
Tris（MW：121.14）	121.14 g	50 mM
EDTA-2Na-2H2O（MW：372.24）	7.44 g	1 mM
SDS（MW：288.38）	20 g	0.1%
ddH₂O	定容至1000 ml

pH7.7

配制方法(1000ml)

①称量并加入至1000 mL烧杯：MOPS 209.26 g、Tris 121.14 g、EDTA·2Na·2H₂O 7.44 g、SDS 20.00 g。

②加入去离子水600 mL，磁力搅拌至各组分完全溶解。

③将溶液转移至1000 mL量筒，以去离子水定容至1000 mL；无需调节pH。

④分装密封，4℃贮存。

（3）各浓度分离胶及浓缩胶配方表（1.5mm厚凝胶）

	8%					12%
分离胶	1块胶	2块胶	4块胶	6块胶	8块胶	1块胶	2块胶	4块胶
ddH₂O	3.7 ml	7.4 ml	14.8 ml	22.2 ml	29.6 ml	2.7 ml	5.4 ml	10.8 ml
3.5×Bis-Tris缓冲液	2.3 ml	4.6 ml	9.2 ml	13.8 ml	18.4 ml	2.3 ml	4.6 ml	9.2 ml
32%丙烯酰胺储液	2.0 ml	4.0 ml	8.0 ml	12 ml	16 ml	3.0 ml	4.0 ml	8.0 ml
10% APS	75 µl	150 µl	300 µl	450 µl	600 µl	50 µl	100 µl	200 µl
TEMED	5 µl	10 µl	20 µl	30 µl	40 µl	3 µl	6 µl	12 µl
总体积	8 ml	16 ml	32 ml	48 ml	64 ml	8 ml	16 ml	32 ml

浓缩胶	1块胶	2块胶	4块胶	6块胶	8块胶
ddH₂O	1.76 ml	3.52 ml	7.04 ml	10.56 ml	14.08 ml
3.5×Bis-Tris缓冲液	0.86 ml	1.72 ml	3.44 ml	5.16 ml	6.88 ml
32%丙烯酰胺储液	0.38 ml	0.76 ml	1.52 ml	2.28 ml	3.04 ml
10% APS	20 µl	40 µl	80 µl	120 µl	160 µl
TEMED	4 µl	8 µl	16 µl	24 µl	32 µl
总体积	3 ml	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

注：总体积为主组分体积，另加 APS/TEMED（不计入总量）

Ø上样缓冲液（4×LDS Loading Buffer）

组分	用量	1X终浓度或百分比
Tris·HCl（MW：157.20）	666 mg	106 mM
Tris（MW：121.14）	683 mg	141 mM
LDS（MW：272.33）	800 mg	2%（m/v）
EDTA-2Na-2H2O（MW：372.24）	7.59 mg	0.51 mM
甘油（MW：92.09）	4.0 g	10%（m/v）
考马斯亮蓝G250（MW：854.04）	7.52 mg	0.22 mM
酚红（MW：354.38）	2.48 mg	0.175 mM
ddH₂O	定容至10 ml

配制方法（10ml）

①称量并依次加入：Tris·HCl 0.666 g、Tris 0.683 g、LDS（十二烷基醚硫酸锂）0.800 g、EDTA-2Na-2H2O 7.59 mg、甘油4.000 g。

②称量加入考马斯亮蓝G-250 7.52 mg与酚红2.48 mg，充分溶解。

③加入去离子水至约8–9 mL充分溶解，随后定容至10.0 mL；置涡旋混匀。

④分装于1.5 mL微量离心管（1.0 mL/管），4℃保存，有效期6个月。

Ø超纯水（ddH2O）

样品的制备

试剂	还原型样品	非还原型样品
样品	X ul	X ul
4×LDS上样缓冲液	2.5 ul	2.5 ul
还原剂10×（500 mM DTT或25% β-ME）	1 ul	—
去离子水	与样品体积和为6.5 ul	与样品体积和为7.5 ul
总体积	10 ul	10 ul

3.聚丙烯酰胺凝胶的配制

（1）凝胶模具准备

①按实验需求选择相应厚度与尺寸的电泳玻璃板（含垫片/间隔片规格一致）。

②以中性洗涤剂彻底清洗玻板与垫片，去除油污与残留物，清水冲净后晾干。

③以75%（v/v）乙醇均匀擦拭脱脂，再用蒸馏水/去离子水复洗，置无尘环境中完全干燥。

④使用前以无尘擦拭纸再次拭净接触面，避免指印与微粒。

⑤按说明书装配并固定于灌胶架/灌胶器：确认垫片位置与方向正确、密封良好，夹具受力均匀，可先以水做快速漏液检查后备用。

（2）分离胶灌制

①在50 mL离心管中依次加入超纯水、32% Acr-Bis溶液和3.5×Bis-Tris胶缓冲液，轻柔混匀至均一。

②随后加入新鲜配制的10% APS与TEMED，迅速充分混匀。

③以5 mL移液器沿玻璃板内侧缓慢灌注分离胶溶液，液面距短玻璃板顶端约1.5 cm处停止（6×8 cm、1.5 mm厚玻板常规灌注体积约3.75 mL）。

④于分离胶表面覆盖约1 cm蒸馏水，使液面平整以隔绝空气。

⑤静置20–40 min；当分离胶与上层水之间出现清晰界面时视为聚合完成。此时弃去上层水，倾斜玻板并以滤纸吸尽残留水分。

（3）浓缩胶灌制

①在50 mL离心管中依次加入超纯水、32% Acr-Bis溶液与3.5×Bis-Tris胶缓冲液，轻柔混匀至均一。

②加入新鲜配制的10% APS与TEMED，快速但充分混匀。

③沿玻璃板内侧缓慢灌注至接近板顶端，垂直插入梳子以形成上样孔；室温静置聚合10–20 min。

④凝胶完全聚合后，可于30 min内使用；如需暂存，将胶连同玻璃板置于自封袋中密封，4°C保存（袋内可加入少量蒸馏水以维持湿度）。

⑤使用时将胶连同玻璃板装入电泳槽，加入电泳缓冲液后小心拔除梳子，按序准备上样电泳。

（4）操作提示

①配制 mini 胶时，可选用 15 mL/50 mL 离心管作容器，通过旋转摇匀或移液器反复吹打混匀。

②大体积配制建议使用匹配容量的烧杯，以玻璃棒充分搅拌。

③无论何种方式，全程尽量避免气泡产生；若出现微泡，沿壁缓慢上升排出后再灌胶。

4.蛋白电泳

（1）样品准备

①预先开启水浴锅或干式金属浴，设定温度为70–100℃。

②将所需体积的蛋白样品转移至1.5 mL微量离心管，并按顺序编号与记录。

③按规定比例加入上样缓冲液，轻柔混匀使其充分均一。

④将样品置于水浴锅/金属浴中加热5 min。

⑤取出后冷却至室温，瞬时离心10–30 s以收集管壁液滴。

⑥按编号顺序整理样品，备用于上样。

（2）电泳

①将凝胶板以上样孔朝上装入电泳槽；分别向内、外槽加入电泳缓冲液：外槽液面需覆盖电极/铂丝，内槽加至完全淹没上样孔。

②垂直、缓慢拔出梳子。上样前以移液器吸取少量电泳缓冲液，对各加样孔进行数次吸排，以去除残留凝胶与气泡。

③采用微量移液器按预设顺序上样，并完整记录样品顺序与体积。

④设定恒压120 V开始电泳；当酚红前沿到达凝胶底缘时终止。可依据目标蛋白的相对分子质量适当调整电泳时长。

（3）操作提示

①优先使用凝胶上样专用吸头，确保样品完整注入上样孔。

②控制上样体积，避免过载与溢入相邻孔，以防条带干扰。

③吸头插入深度勿触及孔底，以免造成条带扭曲；亦不宜过高，避免样品在缓冲液中弥散。

④连续完成加样，缩短样品在孔内滞留时间，降低弥散风险。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/

目录：实验方案（Protocols）

探索主题：凝胶电泳 SDS-PAGE

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《蛋白质Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶电泳系统标准操作规程》. 阿拉丁知识库，更新于 2025年11月7日。
                            https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/standard-operating-procedure-sop-for-bis-tris-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sds-page.html

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