实验方案（Protocols）

SYTOX Orange死细胞染色流式细胞术实验方案

· · 发布于 2026年10月21日 · 更新于 2026年10月21日 ·

SYTOX Orange死细胞染色试剂是一种高亲和力核酸染料，可选择性地渗透细胞膜受损的细胞，从而在流式细胞术和荧光显微镜应用中快速、可靠地区分死细胞与活细胞。

激发/发射波长: 激发波长约547 nm；发射波长约570 nm（橙色荧光）
兼容激光线: 532 nm（绿色）、543 nm 或 561 nm 激光线
工作浓度: 通常在生理缓冲液（如PBS）中配制为1–5 nM
膜通透性选择性: 不能穿透完整细胞膜，仅染色死亡或膜受损细胞
孵育时间: 室温避光孵育5–30分钟
洗涤要求: 采集前无需洗涤步骤；洗涤可降低背景信号
产品货号: S1540206

原理与试剂概述

SYTOX Orange死细胞染色试剂是一种基于花青的膜不可透性核酸染料。在细胞膜完整的活细胞中，该染料无法进入细胞，不产生荧光信号。当细胞膜受损（如凋亡或坏死细胞）时，SYTOX Orange进入细胞并以高亲和力与双链和单链核酸结合，产生明亮的橙色荧光信号，激发波长最大值约为547 nm，发射波长最大值约为570 nm。

这种选择性使SYTOX Orange成为优异的单试剂细胞活力探针，可与多参数流式细胞术检测板兼容。由于无需固定或透化处理，可保留细胞表面抗原完整性，适用于同步免疫表型分析。

主要优势：

单步操作，可选免洗方案
信号明亮，信噪比高
兼容532 nm、543 nm和561 nm激光线
适用于哺乳动物细胞、酵母菌及细菌

材料与试剂配制

所需材料：

SYTOX Orange死细胞染色试剂（S1540206；原液通常为5 mM DMSO溶液）
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，或其他生理缓冲液
微量离心管（1.5 mL）
配备532 nm、543 nm或561 nm激光及适当带通滤光片（如585/16 nm或590/20 nm）的流式细胞仪
细胞培养基和离心机
冰桶和锡纸（用于避光）

工作液配制：

在冰上解冻SYTOX Orange原液，短暂涡旋混匀。
将原液用PBS稀释至1–5 nM工作浓度。例如，将1 µL 5 mM原液加入1 mL PBS配制5 µM中间液，再将1 µL中间液加入1 mL PBS配制5 nM工作液。
现配现用，或避光于4 °C短期保存（≤24小时）。

注意：避免原液反复冻融，首次使用时应分装保存。

分步染色操作流程

1. 收获细胞

采用标准方法收集细胞（贴壁细胞用胰蛋白酶消化，悬浮细胞直接离心）。用PBS洗涤一次，重悬至1×10⁶个/mL，转移100–500 µL至微量离心管或流式管中。

2. 制备阳性对照

为制备死细胞对照，取一份细胞用70%乙醇处理（室温10分钟）或65 °C热处理10分钟，染色前用PBS洗涤。

3. 加入SYTOX Orange工作液

将SYTOX Orange工作液直接加入细胞悬液，使终浓度达到1–5 nM，轻柔吹打混匀，勿涡旋。

4. 孵育

室温避光孵育5–30分钟，建议标准孵育时间为15分钟。

5. 可选洗涤步骤

洗涤步骤非必须，但可降低背景信号。如需洗涤，以300–400 × g离心5分钟，吸去上清，用PBS重悬。

6. 流式细胞仪采集

立即上机检测。使用532 nm、543 nm或561 nm激光激发，用585/16 nm或590/20 nm带通滤光片收集发射光。使用未染色及阳性（死细胞）对照设置门控，每个样品至少采集10,000个事件。

注意：SYTOX Orange染色后请勿固定样品，固定可能改变染色强度并影响细胞活力判断。

仪器设置与数据分析

推荐仪器配置：

参数	推荐设置
激发激光	532 nm、543 nm 或 561 nm
发射滤光片	585/16 nm 或 590/20 nm 带通
检测器	PE通道或等效通道
电压/增益	使用未染色及阳性对照进行调节

设门策略：

建立散点图（FSC vs. SSC），在主细胞群上设门以排除碎片。
在x轴（对数刻度）显示SYTOX Orange荧光强度。死细胞呈现明显的SYTOX Orange阳性（明亮）群体，活细胞呈SYTOX Orange阴性（暗淡或阴性）。
使用未染色对照和死细胞阳性对照设置阴性与阳性群体之间的门控边界。
以SYTOX Orange阳性细胞百分比报告死细胞比例。

光谱注意事项：

SYTOX Orange的发射光谱可能与PE串联染料及其他橙/红色荧光团重叠。运行多色检测板时，请进行光谱解混或补偿，参考仪器的补偿矩阵。

故障排查指南

问题	可能原因	解决方案
活细胞群背景高	染料浓度过高；洗涤不充分	将工作浓度降至1 nM；增加可选洗涤步骤
死细胞信号弱或无信号	染料降解；孵育时间不足；染料浓度过低	使用新鲜配制的工作液；延长孵育至30分钟；浓度提高至5 nM
活死细胞群分离效果差	细胞碎片干扰；设门错误	在FSC/SSC上严格设门排除碎片；使用阳性和阴性对照重新设门
洗涤过程中细胞丢失	离心力过大或沉淀被破坏	降低离心速度；小心吸取上清；考虑使用免洗方案
信号光漂白	孵育或操作过程中光照过度	用锡纸包裹样品；尽量缩短光照时间；染色后立即上机检测

常见问题

SYTOX Orange可用于固定细胞吗？

不建议。SYTOX Orange仅适用于未固定的活细胞样品。甲醛等固定剂会使所有细胞膜通透，导致染料无论细胞活力如何均可进入细胞，从而失去区分活死细胞的能力。

SYTOX Orange与用于免疫表型分析的表面抗体染色兼容吗？

兼容。由于SYTOX Orange无需固定或透化处理，与表面抗体染色完全兼容。建议先进行表面抗体孵育，然后在流式采集前立即加入SYTOX Orange，以保持细胞活力状态的准确判断。

SYTOX Orange的推荐储存条件是什么？

原液应于−20 °C避光保存。首次使用时应分装，避免反复冻融导致染料降解和染色性能下降。工作液应现配现用，或于4 °C避光保存并在24小时内使用。

哪些流式细胞仪通道与SYTOX Orange兼容？

SYTOX Orange最适合由532 nm、543 nm或561 nm激光线激发，在PE通道或等效橙色发射通道（如585/16 nm或590/20 nm带通滤光片）中检测。标准488 nm蓝色激光或633/640 nm红色激光不能有效激发该染料。

除哺乳动物细胞外，SYTOX Orange可用于细菌或酵母菌吗？

可以。SYTOX Orange可用于评估细菌和酵母菌的活力。但最佳工作浓度和孵育时间可能与哺乳动物细胞有所不同，应针对每种微生物类型通过实验确定最优条件。

参考文献

Molecular Probes / Thermo Fisher Scientific. SYTOX Orange Nucleic Acid Stain product information and technical notes.
Rieger AM, Hall BE, Barreda DR. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream seagull responses. Journal of innate immunity, 2010. [General cell viability methodology reference]
Shapiro HM. Practical Flow Cytometry, 4th Edition. Wiley-Liss, 2003. [Textbook reference for flow cytometry principles and viability staining]

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。