简介 

          这种连接化学基于反式环辛烯和四嗪反应对之间的逆需求 Diels-Alder 环加成反应，形成二氢哒嗪键。Tz 和 TCO 反应对显示出非常高的反应特异性。据报道，其特殊的快速动力学为 1~1x106 M-1s-1，是迄今为止文献报道的最有效的生物正交反应。这一不可逆反应过程会释放出 N2 气体，这是反应过程中唯一的副产品。Tz 和 TCO 之间的反应可通过 510 和 550 纳米之间吸收带的消失进行光谱监测。

反应条件： PBS 缓冲液，pH 值：6-9；室温
          该反应可在有机溶剂、水和生物介质中进行，不需要催化剂活化。此外，由于反应的化学选择性很高，反应物可以在很低的浓度下用于与大型生物分子共轭。在 IEDDA 反应中，反式环辛烯（TCO）的反应活性是顺式环辛烯（CCO）的七倍，而且它们对生物系统中存在的硫醇、胺和其他潜在的亲核物没有反应活性。

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         TCO-Tz 兼具超快动力学、选择性和长期水稳定性，是蛋白质-蛋白质共轭等低浓度应用的理想配对。

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特点
        - 生物相容性--无需催化剂--适合体内应用。
        - 条件温和--可在水性缓冲介质中和低温下共轭、
        - 稳定性--TCO 和 Tz 分子长期稳定 
        - 效率--超快的动力学，在高度稀释的条件下形成定量的稳定三唑、
        - 特异性和生物正交性： TCO 仅在 -NH2、-SH、-COOH 和其他蛋白质官能团存在的情况下与 Tz 发生反应

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实验方案（蛋白质-蛋白质共轭） 
通过 TCO-NHS 活化蛋白质 1 
         将 100 μg 蛋白 1 与 5 μl 1M NaHCO3 和 100 μl 基于 PBS 的溶液混合。
        在混合物中加入 20 nmol 的 TCO-PEG12-NHS 酯。这些反应混合物在室温下保持 60 分钟。然后使用旋转脱盐柱进行脱盐。经计算，脱盐后的回收蛋白量为 ~75 μg。

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甲基四嗪对蛋白质 2 的活化作用
        将 100 μg 蛋白质 2 与 5 μl 1M NaHCO3 和 100 μl 基于 PBS 的溶液混合。
        在混合物中加入 20 nmol 甲基四嗪-PEG8-NHS 酯。这些反应混合物在室温下保持 60 分钟。使用旋转脱盐柱（Thermo Fisher，Carlsbad，CA）进行脱盐。经计算，脱盐后的回收蛋白量为 ~75 μg。

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IEDDA 共轭
        将两种反应混合物混合后开始交联反应。TCO 蛋白 1 与 Tz 蛋白 2 按 1:1 的摩尔比混合，旋转 1 小时。共轭物即可使用。

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参考文献

1. Wiessler, Manfred et al., Eur. Pat. Appl., 1867638, 19 Dec 2007

1. Denk, Christoph et al., Bioconjugate Chemistry, 27(7), 1707-1712; 2016;

2. Denk, Christoph et al., Angewandte Chemie, International Edition, 53(36), 9655-9659; 2014;

3. Braun, Klaus et al., International Journal of Medical Sciences, 7(6), 326-339; 2010.

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