1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立基于 TiO₂ 磁珠的外泌体提取操作流程，适用于血清样本中外泌体的快速富集、洗涤与洗脱。该方法适合后续进行外泌体形态观察、粒径分析、蛋白检测、核酸提取及其他下游研究性实验。

1.2 方法原理

（1）TiO₂ 磁珠在适宜缓冲体系中可与样本中的外泌体发生吸附结合，从而实现外泌体与可溶性杂质的初步分离。

（2）在磁场作用下，磁珠-外泌体复合物可被快速回收，并通过 PBS 洗涤去除未结合蛋白、盐分及部分非特异性成分。

（3）在碱性洗脱条件下，结合于磁珠表面的外泌体可从磁珠上释放，形成外泌体悬浮液，供后续分析使用。

1.3 方法特点

（1）操作流程相对简短，适合小体积样本处理。

（2）无需超速离心，可借助磁分离完成回收。

（3）洗脱条件偏碱性，提取后宜尽快进行 pH 调整或后续纯化。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）血清样本。

（2）其他含外泌体体液样本可根据实际体系进行条件优化后参考使用。

2.2 主要试剂

（1）TiO₂ 磁珠，保存浓度为 25 mg/mL，保存于纯水中。

（2）10 mM PBS，上样缓冲液，pH 7.4。

（3）含 10% 氨水的 PBS 洗脱缓冲液，pH 11.1。

（4）25% 氨水，用于洗脱缓冲液配制。

（5）纯水。

2.3 耗材与器材

（1）2 mL 离心管。

（2）磁分离器。

（3）移液器及配套吸头。

（4）涡旋振荡器。

（5）4 ℃ 冷藏环境或低温孵育条件。

（6）超滤装置或其他后处理装置，用于必要时调节洗脱液 pH。

3 缓冲液与样品准备

3.1 上样缓冲液

（1）采用 10 mM PBS。

（2）pH 调节至 7.4。

（3）用于磁珠洗涤、平衡及外泌体结合步骤。

3.2 洗脱缓冲液

（1）采用 10 mM PBS 作为基础缓冲液。

（2）使用 25% 氨水调节至 pH 11.1。

（3）洗脱液中氨水终含量为 10%。

（4）该缓冲液用于将外泌体从磁珠表面释放。

3.3 磁珠准备

（1）TiO₂ 磁珠保存液浓度为 25 mg/mL。

（2）使用前应恢复至室温。

（3）取用前应充分涡旋混匀，使磁珠均匀分散，避免局部沉降导致加样误差。

3.4 样本准备

（1）血清样本应尽量保持澄清，避免明显凝块或颗粒污染。

（2）如样本经冻存，应避免反复冻融。

（3）提取前可根据样本状态进行低速预澄清，但正式条件应保持批间一致。

4 实验流程

4.1 磁珠取样

（1）充分涡旋混匀 TiO₂ 磁珠悬液。

（2）取 200 μL 磁珠悬液转移至 2 mL 离心管中。

（3）该体积对应 5 mg TiO₂ 磁珠。

4.2 首次磁分离

（1）将离心管置于磁分离器上。

（2）静置 30 s，使磁珠完全聚集。

（3）小心移弃上清。

4.3 磁珠洗涤与平衡

（1）向离心管中加入 200 μL 10 mM PBS。

（2）轻柔重悬磁珠，可采用间歇涡旋或轻柔吹打混匀。

（3）室温处理 5 min，以完成磁珠洗涤和平衡。

（4）将离心管重新置于磁分离器上，静置 30 s。

（5）移弃上清。

（6）重复上述洗涤和平衡步骤 1 次。

4.4 外泌体结合

（1）向平衡后的磁珠中加入 100 μL 含外泌体的血清样本。

（2）混匀后于 4 ℃ 共孵育 5～10 min。

（3）孵育过程中应保证磁珠与样本接触充分，但避免剧烈振荡导致泡沫形成。

4.5 磁分离与洗涤

（1）将离心管置于磁分离器上，静置 30 s。

（2）磁分离后移除上清。

（3）加入 10 mM PBS（pH 7.4）重悬磁珠-外泌体复合物。

（4）轻柔混匀后再次磁分离，移弃上清。

（5）按上述方式洗涤 2～3 次，以去除未结合杂质。

4.6 外泌体洗脱

（1）将离心管移出磁场。

（2）向磁珠-外泌体复合物中加入含 10% 氨水的 PBS 洗脱缓冲液。

（3）轻柔混匀后于 4 ℃ 共孵育 5～10 min。

（4）该步骤用于破坏磁珠与外泌体之间的结合，使外泌体释放进入溶液。

4.7 洗脱液收集

（1）将离心管重新置于磁分离器上，静置 30 s。

（2）待磁珠聚集后，小心吸取上清。

（3）所得上清即为外泌体悬浮液。

（4）必要时可采用超滤等方式进一步调节外泌体悬液 pH，以满足后续实验要求。

5 结果与后处理

5.1 提取产物

（1）最终获得的上清为外泌体洗脱液。

（2）洗脱液呈碱性，进入下游检测前宜评估 pH 是否适配后续体系。

5.2 后续处理建议

（1）如需进行蛋白检测、Western blot 或酶学实验，宜先进行缓冲液置换或超滤浓缩。

（2）如需进行核酸提取，应尽量缩短高 pH 暴露时间。

（3）如需用于粒径分析或电镜观察，应保证后处理体系洁净，避免额外盐分和氨残留干扰。

6 常见问题与原因分析

6.1 磁珠回收不充分

（1）磁分离时间不足。

（2）磁珠重悬不均匀，导致局部损失。

（3）吸取上清时操作过快，误吸磁珠。

6.2 外泌体得率偏低

（1）样本中外泌体初始含量较低。

（2）磁珠洗涤次数过多或操作过强，造成部分外泌体损失。

（3）结合孵育时间不足，磁珠与样本接触不充分。

6.3 洗脱后下游实验受抑制

（1）洗脱液碱性偏强，未及时进行 pH 调整。

（2）氨水残留对蛋白、核酸或酶学检测造成干扰。

（3）应结合下游用途增加超滤、缓冲液置换或浓缩步骤。

6.4 样本背景杂质偏高

（1）血清本身蛋白含量高，非特异性共提取增加。

（2）PBS 洗涤次数不足。

（3）样本前处理不一致，导致批间纯度波动。

7 安全与操作规范

7.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理氨水及碱性洗脱液时应在通风条件良好的环境下操作。

7.2 试剂安全

（1）氨水具有腐蚀性，应严格按照安全使用说明操作。

（2）如试剂接触皮肤、眼睛或操作台面，应立即按实验室安全规范处理。

7.3 废液处理

（1）含氨水、PBS 及样本残液的废液应分类收集。

（2）所有废液及污染耗材应按实验室化学品和生物样本处理规范处置。

8 外泌体提取相关试剂与材料选型

表1 外泌体提取相关试剂与材料选型

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[1] 外泌体的来源、生物学功能、分离鉴定与应用前沿