实验方案（Protocols）

TMB超灵敏液体底物用于ELISA的实验方案

· · 发布于 2026年10月23日 · 更新于 2026年10月23日 ·

3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate, Supersensitive, for ELISA是一种即用型单组分显色HRP底物，可在酶联免疫吸附实验中实现对低丰度抗原的高灵敏度检测。

产品货号: T755518
参考标准品: Sigma-Aldrich T4444
应用: ELISA（酶联免疫吸附实验），配合HRP标记的检测抗体使用
检测波长: 450 nm（加入终止液后）；650 nm（动力学检测/不加终止液）
产品形式: 单组分即用型液体底物
灵敏度: 超灵敏配方，适用于低丰度靶标的检测

原理与概述

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）是辣根过氧化物酶（HRP）的显色底物。在HRP和过氧化氢存在下，TMB被氧化生成蓝色产物。加入终止液（通常为稀硫酸）后，颜色由蓝色转变为黄色，最大吸收波长为450 nm。该比色变化可用于定量检测HRP信号，其强度与实验中捕获的抗原量成正比。

超灵敏配方（Aladdin T755518，参考Sigma T4444）经过专项优化，与标准TMB底物相比可提供更强的信号强度，能够可靠检测常规配方检测限以下的低丰度分析物。

所需材料

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺液体底物，超灵敏型（Aladdin T755518）
ELISA终止液（如1 M H₂SO₄或2 N H₂SO₄）
HRP标记的检测抗体
96孔酶标板（ELISA级）
可在450 nm和650 nm下测量吸光度的酶标仪
多通道移液器及试剂槽
计时器
洗涤步骤用蒸馏水或去离子水

注意：使用前将所有试剂平衡至室温（18–25 °C）。TMB底物在储存和操作过程中应避免光照。

逐步操作方案

准备：完成所有前序ELISA步骤（包被、封闭、样本及一抗孵育、洗涤）。确保在HRP标记的检测抗体步骤后对酶标板进行充分洗涤，以降低背景信号。
加入底物：向每个孔中加入100 µL TMB超灵敏液体底物（T755518）。使用多通道移液器以确保各孔加样时间一致。
孵育：在室温（18–25 °C）避光条件下孵育5–30分钟。目视监测显色情况。当阳性对照孔显色充分、阴性对照孔背景较低时停止反应。
终止反应：按加入底物的顺序和速度，向每个孔中加入100 µL终止液（如1 M或2 N H₂SO₄）。酸化后溶液应由蓝色转变为黄色。
吸光度读取：在终止反应后30分钟内读板。在450 nm处测定主波长吸光度。可使用570 nm或630 nm作为参考波长进行背景校正。若不使用终止液（动力学检测），则在650 nm处测定。

注意：若加入终止液后某些孔仍呈蓝色或绿色，可能提示终止不完全或信号极强，请核查终止液浓度并确保充分混匀。

故障排查与操作提示

问题	可能原因	建议措施
所有孔背景偏高	洗涤不充分；底物被HRP污染	增加洗涤次数；使用新鲜底物；避免与金属接触
无显色	HRP失活；底物过期或储存不当	检查抗体偶联物活性；确认储存条件（2–8 °C，避光）
板内显色不均	孵育温度或时间不一致	使用板盖；用多通道移液器快速加入底物
加入终止液后颜色未转黄	终止液用量或浓度不足	核查终止液；确保与底物体积比为1:1

为获得最佳结果，请避免底物反复冻融，若底物在使用前已变蓝，说明已被氧化、灵敏度下降，请勿使用。

储存与安全

储存：TMB超灵敏液体底物（T755518）应于2–8 °C避光保存，不得冷冻。请以产品标签和质量检验报告（COA）上标注的有效期为准。使用前若底物已变蓝，应予废弃。

安全：TMB急性毒性较低，但操作时仍应遵守标准实验室安全规范，佩戴手套、实验服及护目镜等个人防护装备。终止液（H₂SO₄）具有腐蚀性，操作时须谨慎，完整危害信息请参阅安全数据表（SDS）。废弃物处置应符合当地机构及法规要求。

常见问题

TMB超灵敏液体底物应使用何种终止液？

TMB法ELISA标准终止液为稀硫酸溶液（通常为1 M或2 N H₂SO₄）。每孔加入100 µL（与底物等体积），可将蓝色TMB产物转变为稳定的黄色产物，于450 nm处读取。终止液应与底物的加样顺序和速度保持一致，以确保结果的一致性。

超灵敏TMB底物与标准TMB底物有何区别？

超灵敏配方经过优化，每单位HRP酶产生的显色信号强于标准TMB底物，特别适用于低丰度抗原的检测，或需要降低HRP标记抗体用量的实验。对于高丰度靶标，标准TMB底物可能已足够，但超灵敏版本可进一步降低检测下限。

TMB底物加入孔中后，反应最长可持续多久才需终止？

通常在室温避光条件下孵育5至30分钟。最佳孵育时间应根据每个实验具体情况，通过观察阳性对照孔显色充分、阴性对照孔接近基线时来确定。超过30分钟的长时间孵育可能导致背景升高和结果非线性，尤其对超灵敏配方更为明显。

如何储存TMB超灵敏液体底物以保持其性能？

应于2–8 °C避光保存，不得冷冻，反复冻融会导致性能下降。若底物在使用前已呈蓝色，说明已被氧化，应予废弃。使用前请核查标签及质量检验报告上的有效期。

参考文献

Sigma-Aldrich Product T4444: 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate System for ELISA, Supersensitive. Sigma-Aldrich Co. LLC. Reference cited in Aladdin product T755518 documentation.

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

目录：实验方案（Protocols）

探索主题：免疫检测比色法检测 TMB底物 HRP检测酶联免疫吸附实验

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。