一、实验目的

利用酒石酸抗性酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）活性染色，选择性标记破骨细胞及其他TRAP阳性细胞，通过显微镜观察细胞形态和染色强度，对破骨细胞分化、成熟及功能相关的变化进行形态学判定与半定量分析，适用于体外破骨细胞分化模型。

二、实验原理

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是一类在酸性条件下水解磷酸酯底物的水解酶。破骨细胞中存在一种对酒石酸不敏感的酸性磷酸酶同工酶，即TRAP。

在TRAP染色体系中，提供适宜pH的酸性缓冲液和磷酸酯底物（如萘酚AS-BI磷酸盐等），TRAP催化底物水解释放出酚类中间产物，随后与显色剂（如Fast Red、Fast Violet或Fast Garnet等）偶联生成不溶性色素沉淀，使TRAP活性部位在光学显微镜下呈现红色或紫红色颗粒状着色。

体系中加入一定浓度的L(+)–酒石酸，可抑制除TRAP之外的大部分ACP活性，从而显著提高破骨细胞TRAP染色的特异性。典型成熟破骨细胞表现为多核、大体积、胞质广泛TRAP阳性，而未分化或非破骨细胞多数呈TRAP阴性或弱阳性。

三、适用范围

各类破骨细胞体外分化模型（如骨髓来源单核细胞、巨噬细胞系诱导获得的破骨细胞）。

贴壁培养的骨相关或造血来源细胞中TRAP阳性细胞的检测。

不同药物、细胞因子、基因操作等对破骨细胞分化和功能影响的评价。

四、试剂与材料

1.试剂

二甲苯

无水乙醇、梯度乙醇（如75%–95%）

冰醋酸、醋酸钠（配制醋酸缓冲液用）

副品红（Pararosaniline）

亚硝酸钠（NaNO₂）

萘酚AS-BI磷酸酯

苏木素染色液

盐酸酒精溶液（用于分化）

氨水或返蓝液

正丁醇

中性树胶封片剂

去离子水或蒸馏水

PBS缓冲液或生理盐水（可选，用于洗涤）

2.材料

石蜡包埋组织块及石蜡切片（推荐厚度3–5 μm）

冰冻切片（如适用）

载玻片（建议防脱载玻片）、盖玻片

防水组化圈笔

一次性移液器枪头、滴管/巴斯德吸管

滤膜及一次性过滤装置（0.22–0.45 μm）

湿盒（湿润室）、培养皿、托盘

光学显微镜及图像采集系统

37℃恒温孵育箱或培养箱

旋转式石蜡切片机和/或冰冻切片机（用于前期制片）

烤片机（如对石蜡切片需烤片）

五、操作步骤

1、石蜡切片脱蜡至水

将石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-酒精Ⅲ5 min中处理，随后自来水充分漂洗至完全水化。（冰冻切片可直接用自来水漂洗备用。）

2、染液

A液：冰醋酸缓冲液；B液：六偶氮副品红（临用前将亚硝酸钠溶液与副品红溶液按等体积混合）；C液：萘酚AS-BI磷酸酯液。TRAP染液配制：取B液1 mL + A液18 mL + C液1 mL，混匀后过滤，即为TRAP工作染液。

3、孵育

用组化笔在切片周围化圈，将切片置于湿盒中（盒内加入适量纯水以防切片干燥），37 ℃条件下以纯水孵育2 h，始终保持切片湿润。

4、染色

孵育结束后倾去切片表面纯水，滴加预先过滤好的TRAP工作液覆盖组织，置于37 ℃避光反应1 h。

5、苏木素染细胞核

切片经自来水轻洗后入苏木素染色液1–3 min，自来水冲洗；再入盐酸水溶液分化数秒，自来水冲洗后置于氨水水溶液中返蓝，最后流水充分冲洗。

6、脱水封片

切片依次放入无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-正丁醇5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min脱水透明，将切片自二甲苯中取出稍晾干，以中性树胶封片。

7、显微镜镜检，图像采集分析