LT-VTAG-24规格说明
应用：用于糖肽的荧光标记和富集。

描述：该试剂盒包含V-tag染料（LT-VTAG-01）与糖肽胺部分结合所需的试剂，以及纯化和富集标记糖肽所需的专用固相萃取（SPE）盒。

染料性能：质量=434.42（导致糖肽质量增加319.33 Da。）荧光，λ_ex= 250 nm,λ_em= 360 nm。

样品数量：每个试剂盒24个单独的分析样品。

样品量：每个样品约含1µg至50µg糖蛋白。
合适的样品：IgG单亚类糖蛋白。可以使用其他糖蛋白，但是，如果存在多个糖基化位点，在HILIC分析之前，需要通过C18 HPLC对糖肽进行分离。建议样品不含胺溶剂（如Tris型缓冲液）或还原/烷基化试剂，因为它们会干扰V-tag标签。去除含胺的溶剂和还原/烷基化剂可以使用为脱盐和缓冲交换而设计的设备来完成，以及去除低分子量的化合物。

标记选择性：每个IgG糖肽N端有一个V-tag。
存储：将V-tag染料储存在-20°C的暗处。保护免受热源、光源水分。一旦使用，多余的染料溶液可以冻结和重复使用。

运输：产品可在常规温度下装运

处理：确保任何玻璃、塑料制品或溶剂不含不需要的肽酶，糖苷酶和环境碳水化合物。对所有样品使用无粉手处理，并避免环境碳水化合物的污染。

安全性：仅供研究使用。不用于人体或药物使用。

所需的其他试剂和设备

• 温箱、烤箱或类似的干式加热器，设置在37°C，用于标记反应

• 反应瓶（例如聚丙烯微型离心瓶）

• 收集瓶（例如聚丙烯微型离心瓶）或96深孔板

• 移液管（1至10µL、10至100µL、20至200µL和100至1000µL容量）

• 涡流离心机

• 乙腈（LC/MS级）

• 18.2 MΩ·cm 水

• 96孔板抽真空歧管和真空泵（任选）
  

标记时间线

糖肽的V-tag标记和富集方法大约需要2.5小时：

标记反应

1，V-tag染料溶液解冻

使用前在室温下轻轻解冻。一旦使用了V-tag染料，备用溶液可以再次冷冻并重复使用。与许多荧光染料一样，应注意尽量减少光照，因为光照会随着时间的推移降解染料。

2，向样品中添加V-tag染料

将5μL V标记染料直接添加到每个酶消化样品中。用涡流离心机短暂离心样品。

3，孵育

将反应瓶置于37°C的温箱或干燥烘箱中，孵育1小时。

4，离心和冷却

孵育期结束后，短暂离心微管，使其完全冷却至室温。

5，准备洗涤溶液

使用10%TFA、乙腈和水制备溶液1、2和3。

溶液2和3的注意事项：应通过测量将水、乙腈和TFA单独准确地混合在一起。这些溶液对于获得良好的富集效果至关重要。

溶液1.将1mL 10%TFA溶液加入99 mL水中。

溶液2.152 mL ACN、46 mL水和2 mL 10%TFA溶液混合在一起。

溶液3.40 mL ACN、59 mL水和1 mL 10%TFA溶液混合在一起。
6，准备LC-A柱

将每个样品的LC-A柱放入支架中，并放置在真空操作台上。

通过添加以下溶液，缓慢抽真空排空并丢弃流通液，为每个LC-A柱加注润滑油。

7，制备糖肽样品并应用于LC-A柱

用移液管将150µL 100%乙腈移到荧光团标记的样品中（通常荧光团标记混合物+糖肽样品的体积为15-25µL）。用移液管轻轻混合样品，并立即将每个样品装入已涂好底漆的过滤柱中。等待5分钟，然后缓慢抽真空（大约需要一分钟）以排空LC-A滤柱。

注：为了避免样品沉淀，应在加入乙腈之前将样品加到柱上。

8，清洗LC-A滤芯

用3 x 1 mL 76%乙腈、0.1%TFA溶液清洗滤柱，并丢弃通流管。

9，洗脱标记的糖蛋白

拆下滤筒支架，将深井收集板放在真空歧管中，然后将滤筒支架重新放在顶部。

通过向每个滤筒中加入0.5mL 0.1%TFA/40%乙腈溶液洗脱标记的糖肽，并等待5分钟。缓慢抽真空约一分钟以完全洗脱样品。

V-tag标记的糖肽分析

U/HPLC分析

V-tag标记的糖肽混合物可以通过各种U/HPLC（高压液相色谱）方法进行分离和分析。为了获得最佳分辨率结果，我们建议使用UHPLC分离。下面详细介绍了用于Vtag标记的胰蛋白酶消化的IgG-1抗体的建议UHPLC条件。

UHPLC样品制备：

1，在0.1%TFA/40%乙腈溶液+35µL ACN中加入25µL LC-A洗脱的糖肽。

2，进样：25µL

3，注入方式：部分回路，50μL回路，注入溶液80%乙腈

4，洗脱液A:50 mMol甲酸铵，pH=4.4

5，洗脱液B：乙腈。

6，温度：60°C

7，检测：荧光 λ_ex= 250 nm，λ_em= 360 nm

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