AkaLumine盐酸盐近红外荧光素酶生物发光成像实验方案
AkaLumine盐酸盐近红外荧光素酶生物发光成像实验方案
AkaLumine hydrochloride is …AkaLumine盐酸盐是一种合成的近红外移位荧光素类似物，作为工程化Akaluc荧光素酶的高效底物，与传统D-荧光素相比，能够显著降低组织自发荧光，实现活体动物深层组织的生物发光成像。
- 化学类别
- 合成荧光素类似物（氨基荧光素衍生物）
- 主要应用
- 配合Akaluc荧光素酶进行近红外活体生物发光成像
- 发射峰
- 约650–700 nm（相对于D-荧光素约560 nm的红移/近红外移位）
- 溶解性
- 可溶于DMSO及碱性pH水性缓冲液（如PBS）；建议现配现用或分装后于−20°C保存
- 兼容荧光素酶
- Akaluc（由Pyrearinus termitilluminans荧光素酶工程改造而来）及其他红移荧光素酶
- Aladdin货号
- T487470
背景与原理
AkaLumine盐酸盐是一种近红外荧光素类似物，旨在克服传统生物发光成像的深度局限性。标准D-荧光素与萤火虫荧光素酶（FLuc）反应产生约560 nm的光子，该波长会被血红蛋白及其他组织发色团强烈吸收。AkaLumine专为与工程化荧光素酶Akaluc配对而设计，可在650–700 nm范围内产生生物发光。在这些更长的波长下，光子穿透哺乳动物组织的能力大幅提升，组织自发荧光也随之降低，从而能够在小鼠模型的胸腔、腹腔等深层解剖区域检测到报告基因信号。
Akaluc/AkaLumine系统尤其适用于在活体动物中追踪少量细胞（如循环肿瘤细胞、干细胞、免疫细胞）、开展肿瘤纵向研究，以及任何需要高灵敏度和深层空间分辨率的应用场景。由于AkaLumine为盐酸盐形式，其水溶性优于部分其他荧光素类似物，有利于制备稳定的给药溶液。
材料与设备
试剂：
- AkaLumine盐酸盐（Aladdin货号：T487470）
- 无水二甲基亚砜（DMSO），用于配制储液
- 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，无菌
- 适合所用细胞系的细胞培养基
- 表达Akaluc的细胞系或动物模型
设备：
- 分析天平及经校准的移液器
- 微量离心管（1.5 mL，建议使用低吸附型）
- 生物安全柜（细胞操作用）
- 配有发光检测模块的荧光素酶检测仪或酶标仪（体外实验用）
- 可检测近红外发射的活体光学成像系统（建议使用650–750 nm带通滤光片）
- 异氟烷麻醉系统（小动物活体成像用）
- 胰岛素注射器（29–31 G），用于皮下或腹腔注射
- −20°C及−80°C冰箱，用于试剂储存
详细操作步骤
A部分：AkaLumine储液配制
- 开封前，将AkaLumine盐酸盐样品瓶在干燥器内平衡至室温，以防止冷凝水污染。
- 使用分析天平称取所需量的AkaLumine盐酸盐。
- 用无水DMSO溶解，配制浓缩储液（如50–100 mM）。轻轻涡旋，确保完全溶解。注意：避免长时间暴露于光照下，建议用铝箔包裹离心管。
- 分装为单次用量，以减少冻融次数。短期（≤1个月）存于−20°C，长期存于−80°C。勿存放于无霜冰箱。
- 配制水溶性工作液时，使用前立即将DMSO储液稀释于无菌PBS（pH 7.4）中。细胞实验中最终DMSO浓度≤1%（v/v），活体注射≤5%（v/v）（请根据您的模型验证耐受性）。
B部分：体外细胞荧光素酶检测
- 将表达Akaluc的细胞以适当密度（通常每孔10,000–50,000个细胞）接种于白色或黑色不透明96孔板中，实验前培养24小时，使细胞达到60–80%汇合度。
- 将AkaLumine用完全培养基配制为所需浓度的工作液（建议起始浓度范围：1–100 µM；根据细胞系和荧光素酶表达水平进行优化）。
- 吸去孔中原有培养基，每孔加入100 µL AkaLumine工作液。
- 在37°C、5% CO₂条件下孵育10–30分钟，使底物摄取并完成反应平衡。
- 立即使用荧光素酶检测仪或酶标仪检测发光信号，记录相对光单位（RLU）。如需动力学测量，可在多个时间点读数。
- 每次实验均需设置阴性对照（不表达荧光素酶的亲本细胞+AkaLumine）和底物空白对照（表达细胞+溶剂）。
C部分：啮齿动物活体生物发光成像
- 配制注射液：将DMSO储液稀释于无菌PBS中至目标浓度。常用剂量范围为1–10 mg/kg体重，腹腔注射（i.p.）或静脉注射（i.v.）；请根据模型进行优化。标注：具体剂量需依据机构IACUC方案进行验证。
- 使用前立即通过0.22 µm注射器滤膜过滤注射液。
- 按照机构动物管理规程，使用异氟烷对动物进行麻醉（诱导2–3%，氧气维持1.5–2%）。
- 使用适当规格针头，经腹腔或静脉途径注射AkaLumine溶液。
- 将麻醉动物放入具有近红外检测能力的活体光学成像系统成像仓中，根据目标解剖区域选择背部或腹部朝上放置。
- 注射后5–15分钟开始采集图像（信号通常在此窗口内达到峰值；请实验优化时间点）。
- 使用650–750 nm带通滤光片（或根据系统和背景情况使用开放滤光片以最大化光子收集）采集图像。根据信号强度设置曝光时间（弱信号建议从1–5分钟开始）。
- 使用成像系统软件定量生物发光信号，以感兴趣区域（ROI）的总光通量（光子/秒）表示结果。
- 成像结束后，将动物置于温暖环境中从麻醉中恢复，并按机构规程进行监护。
故障排除
| 问题 | 可能原因 | 建议解决方案 |
|---|---|---|
| 无信号或信号极弱 | 底物降解；荧光素酶表达不足；荧光素酶-底物不匹配 | 重新配制新鲜AkaLumine溶液；通过Western blot或qPCR验证Akaluc表达；确认AkaLumine与Akaluc或兼容的红移荧光素酶配合使用，而非标准FLuc |
| 背景高/自发荧光强 | DMSO浓度过高；底物非特异性相互作用；滤光片选择不当 | 细胞实验中将DMSO降至≤1%；使用650–750 nm带通滤光片；设置无底物对照 |
| 活体信号峰值时间未捕捉到 | 注射后图像采集开始过早或过晚 | 开展动力学预实验：注射后每5分钟成像一次，连续60分钟，绘制您模型的信号时程曲线 |
| 实验间结果不一致 | 冻融降解；细胞密度不均；注射体积或部位不一致 | 使用单次用量分装；标准化细胞接种密度；按体重给药并保持注射操作一致性 |
| 水溶液中出现沉淀 | pH过低或DMSO储液加入冷PBS过快 | 确保PBS处于室温且pH 7.4；将DMSO储液在涡旋状态下逐滴加入；如仍有沉淀，可使用偏碱性PBS |
数据分析与报告
定量分析：使用成像软件中的感兴趣区域（ROI）分析工具，在生物发光灶上绘制ROI。以总光通量（光子/秒，p/s）报告信号；若比较不同大小的区域，需按ROI面积归一化。纵向研究中，每个时间点应使用相同的ROI尺寸和位置。
归一化：将体外RLU值归一化至细胞数量（如通过同步CellTiter-Glo或结晶紫实验）或蛋白浓度，以消除细胞密度差异的影响。活体数据需报告每只动物的体重和注射剂量。
统计分析：以均值±SEM或均值±SD表示数据，n≥3个生物学重复。选用合适的统计检验方法（两组比较用非配对t检验；多组比较用单因素方差分析加事后校正）。报告精确p值。
每次实验必须包含的对照：
- 阴性对照：亲本细胞（不表达Akaluc）或野生型动物接受AkaLumine处理
- 底物对照：表达Akaluc的细胞或动物仅接受溶剂处理
- 阳性对照（如有）：已知细胞数量或标准生物发光参考物
图像显示：同一实验内所有图像应使用统一的伪彩色标尺（最小值和最大值）。在图注中注明色标范围和曝光时间。
常见问题
AkaLumine盐酸盐能否与标准萤火虫荧光素酶（FLuc）联用，而非Akaluc？
AkaLumine针对Akaluc及其他红移/工程化荧光素酶进行了优化。虽然与野生型萤火虫荧光素酶（FLuc）可能存在一定活性，但显著低于D-荧光素与FLuc的组合，也远低于Akaluc/AkaLumine配对体系的效率。为获得最佳效果，请仅将AkaLumine用于表达Akaluc的系统。
AkaLumine盐酸盐的推荐储存条件和保质期是什么？
固体粉末应在密封、干燥、避光的条件下于−20°C保存。配制好的DMSO储液应分装后于−20°C保存（最长1个月）或于−80°C长期保存。避免反复冻融，以防底物降解影响生物发光信号。水溶性工作液应在使用前即时配制。
小鼠活体成像时应使用多大浓度的AkaLumine？
已发表文献中，Akaluc/AkaLumine系统的活体给药剂量通常为1–10 mg/kg体重，经腹腔或静脉注射。最佳剂量取决于您的具体动物模型、肿瘤负荷及成像系统灵敏度。建议先开展剂量-反应预实验，确定在您实验条件下信噪比最大化的剂量。请务必遵守机构IACUC批准的动物实验方案。
为什么AkaLumine溶液在用PBS稀释时会出现沉淀？
沉淀通常发生在DMSO储液快速加入冷的或低pH水性缓冲液时，或溶液pH低于分子pKa时。为防止沉淀，请确保PBS处于室温且pH 7.4，在涡旋状态下逐滴加入DMSO储液，并尽量降低最终DMSO含量。若沉淀持续出现，可尝试短暂超声或使用稍偏碱性的PBS（pH 7.4–8.0）。
AkaLumine盐酸盐是否可与D-荧光素联用于多重生物发光成像？
可以。Akaluc/AkaLumine的发射峰（约650–700 nm）与标准FLuc/D-荧光素的发射峰（约560 nm）之间存在明显的光谱分离，适合用于双报告基因生物发光多重成像。通过选用合适的带通滤光片，可以在同一动物体内区分表达Akaluc和FLuc的细胞群体信号。需谨慎选择滤光片并设置充分对照，以尽量减少光谱串扰。
参考文献
- Nagai T, et al. A bioluminescent reporter with expanded dynamic range and a long emission wavelength for imaging in deep tissue. Nat Biotechnol. 2018.
- Iwano S, et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 2018;359(6378):935-939. doi:10.1126/science.aaq1067
- Suzuki K, et al. Development and characterization of AkaLumine for near-infrared bioluminescence imaging. [Placeholder — verify author list, journal, year, and DOI from primary literature].
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