在优化实验条件时，应该同时用含有甘油和不含甘油的凝胶分离PCR产物，并对放射性自显影的结果进行比较。利用这两种凝胶分析同一种样品的预实验结果可以在24h之内获得。一旦实验条件确定下来，特定实验所优选的凝胶类型就可以应用到该基因座的所有样品的分析中。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

操作方法

凝胶电泳实验

材料与仪器

丙烯酰胺 双丙烯酰胺储存液 过硫酸铵 乙醇 上样（终止）缓冲液 甲酰胺 EDTA 溴酚蓝 二甲苯腈 酶和酶缓冲液 PCR 产物（放射性） 凝胶 培养基
ZapCap 过滤器 108 孔深井式梳子 色谱纸 上样器 丙烯酸防护板 胶片暗盒 凝胶印迹膜 盖革计数器 凝胶干燥系统 胶片 S2 型测序仪 石蜡封口膜 移液管 剃须刀片 试剂储存器 热循环仪（PCR 仪）

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存液，37.5:1(BIORAD)

10% 过硫酸铵

配 100 ml，然后分装成 10 ml 小份存于-20°C。螺旋盖硼硅酸闪烁管（screw-cap borosilicate scintillation vials) 是很好的储存容器。

乙醇，95%

2X 上样（终止）缓冲液

95% 甲酰胺

20 mmol/LEDTA

0.05% 溴酚蓝 (Sigma-AldrichB5525)

0.05% 二甲苯腈（xylenecyanol)(Sigma-AldrichX4126)

配 300 ml, 然后分成小份装入 15 ml 锥形管中，-20°C 保存。为便于用多道移液器吸取，转移一小份至灭过菌的试剂储存器或储存槽内（Eppendorf 或 Apogent Discoveries)

10XTBE 电泳缓冲液

Tris 碱                   18 g

硼酸                      55 g

EDTA                    9.3 g

ddH₂O 至               1L

N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED)

Safety Coat Non Toxic Glass Plate Coating（注意：易燃）

2. 酶和酶缓冲液

3. 核酸和寡核苷酸

方案 2 中的 PCR 产物（放射性）

4. 凝胶

（1）含 10% 甘油的 SSCP 凝胶混合物（终％C=2.67%)

10XTBE                          50 ml

40% 丙烯酰胺 (37.5:1)   75 ml

ddH₂O                            325 ml

用 0.45um 的 ZapCap 口过滤澄清，加入 50 ml 超纯级的甘油，4°C 避光保存（用铝箔纸包裹溶液瓶）。

（2）不含甘油的 SSCP 凝胶混合物（终％C=2.67%)

10XTBE                           50 ml

40% 芮烯酰胺 (37.5:1)    75 ml

ddH₂O                             375 ml

用 0.45um 的 ZapCap 过滤澄清，4°C 避光保存（用铝箔纸包裹溶液瓶）。

5. 培养基

6. 专用设备

0.45um 的 ZapCap 过滤器（SchleicherSchuell)

108 孔深井式梳子（108-welldeep-wellcomb)

这是一种方井形的梳子，在美国加利福尼亚州旧金山市的凝胶公司定制加工（www.gelcompany.com，1-800-256-8596)。这种类型的梳子比鲨鱼齿梳子（shark，stoothcomb) 更好，这是由于它可以形成明显的单个的加样槽。鲨鱼齿梳子可能导致的相邻加样槽之间的样品相互滲漏或混合的现象不会在方丼形梳子上发生，而这种滲漏或混合会干扰数据的判读。

3 MM46 cmX57 cm 色谱纸（Whatman)

8 道注射凝胶上样器（Hamilton)
应该指出的是买 84501 型 12 道上样器会更经济。通过去除两端各 2 个注射头，共 4 个注射头，将自动留出空闲的部分用于维护。注射头需要定期更换，单独定购会更贵，而且它们经常缺货，这样会耽误实验进度。

丙烯酸防护板

试剂瓶，125 ml

锥形管，15 ml

带增感屏的胶片暗盒

GB002 凝胶印迹膜（Schleicher&Schuell)

盖革计数器（一种放射能测定器）

凝胶干燥系统（BioRadModel583withHydrotechpump 或类似系统）

Kimwipe(—种薄软吸水纸，商品名）纸巾或其他无尘纸

KodakXAR514X17 胶片

大夹子

S2 型测序仪（过去由 LifeTechnologies 供货，现在由 WhatmanBioMetra 提供），带0.4 mm 的垫片（隔板）和标准坡璃板

Parafilm 石蜡封口膜

移液管，50 ml

电源.

剃须刀片

试剂储存器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)

SafetyCoatNonToxicCoating(JTBaker)(注意：易燃）

保鲜膜（莎纶纸，SamnWrap)

注射器

热封膜（thermaladhesivesealingfilm，FisherScientific)，当样品变性时用来封闭 96孔板

热循环仪（PCR 仪），或者热块

二、方法

1. 玻璃板的安装

（1）在安装之前，小玻板应该用硅烷化剂如 Safety Coat Non Toxic Glass Plate Coating处理，处理过程按厂商的说明书进行。

（2）用软海绵和非研磨型去垢剂清洗玻板。玻板必须非常干净并且没有纸屑以减少气泡的形成。

（3）用 ddH₂0 冲洗玻板，并用一张大的 Kimwipe 纸巾擦洗。再用 95% 乙酵冲洗，最用 Kimwipe 纸巾擦干。
水应该能在小玻板上凝成小水珠。

（4）将干净的垫片放在大破板表面，将小破板放在上面，保证垫片的泡沫块与小玻板顶端平齐以免发生泄漏。

（5）沿着边缘将玻板夹在一起（每边约 4 个夹子）。夹子内侧不可超过垫片的边缘。

（6）将玻板装置水平放置，但微微抬高（聚苯乙烯泡沫塑料管架很好用）。拿出梳子和其他材料用于凝胶的制备。

2. 凝胶的灌制

（1）转移 75 ml 凝胶混合物到 125 ml 瓶中。加入 37ulTEMED, 用 Parafilm 石蜡封口膜上，剧烈摇荡。加入 705ul10% 的过硫酸铵：用 Parafilm 石蜡封口膜封上，剧烈摇荡。用其空仪抽掉空气。

（2）用 50 ml 的移液管吸满凝胶溶液，倾斜夹好的玻板（玻板的顶端高些），将移液管玻板顶部的一端移到另一端，使凝胶溶液缓慢地、均匀地分散到两破板之间。当凝胶到达底部时，将玻板放平。在玻板之间迅速插入凝胶梳子的齿子。加样槽的顶端应当与玻板的边缘平齐。

（3）在梳子边缘的破板上夹上另外的夹子。

（4）让凝胶聚合至少 40 min。

3. 凝胶的装备

（1）取下所有夹子。

（2）用剃须刀片在梳子下方轻轻松动，然后慢摱地均匀地取下梳子。

（3）将破板放入凝胶盒中，在缓冲液室倒满 1XTBE。

（4）用注射器吸取 1XTBE 缓冲液冲洗加样槽。如果加样槽弯曲，用一扁平的移液器吸头把加样槽之间的齿弄直。

（5）凝胶的预跑是不必要的，继续制备样品并上样。

4. 样品的制备和电泳

（1）如果方案 2 中的 PCR 产物已经冻存，则先融化，然后短暂离心甩下盖子和管壁上的溶液。
PCR 产物是放射性的，操作时需要适当的防护。

（2）小心地移去盖子。用盖革计数器对手套的放射能进行测定，必要时更换手套。
用 Kimwipe 纸巾包裹移开盖子可以减少对手套的放射性污染。

（3）用多道移液器加入等体积的（12.5ul)2X 终止缓冲液到所有的样品中。吹打混匀用热封膜盖住玻板。

（4）将样品在 95°C 的热块或 PCR 仪上变性 5 min，然后迅速置于冰上。揭开热封膜并丢弃，换手套，用多道注射凝胶上样器上样。剩下的样品可以保存在-20°C。

（5）用电源线连接凝胶盒和电源，打开电源。

注意：高电压。
先在约 40W 下使样品逬入凝胶中。如果使用的是含甘油的凝胶，将功率降低到 8W，电泳约 17 h(过夜）。如果使用的是不含甘油的凝胶，将功率降低到 25W, 电泳约 6 h。电泳直至二甲苯腈（上样缓冲液中的染料）跑完凝胶近 2/3 时。

（6）当电泳完成时，关闭电源，断开电线与凝胶电泳盒之间的连接。从凝胶电泳盒上取凝胶，将小玻板朝上平放。滑出两个垫片，用剃须刀片撬开上面的玻板。

（7）把 Whatman3 MM 滤纸放在胶上，轻轻地压一压，不可擦破。放一张印迹膜在上面轻轻地压一压。一只手在下面托住玻板，另一只手放在印迹膜上，倒转装置。将玻板撬离凝胶表面。剪去凝胶周围多余的纸，用保鲜膜盖上。

（8）在 80°C 将凝胶干燥约 45 min，转移到胶片暗盒中，X 射线胶片曝光（在优化实验时可以确定曝光时间）。将底片显影，标记样品，分析。
在整个实验进行时及实验完成后，一定要用盖革计数器检査所有工作区域和仪器。清扫和排除污染是必要的。

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