细胞的冻存实验是指对体外培养的细胞通过加入液氮进行保护。以维持其各种生物特性，减少培养器皿、培养液等的消耗。

原理

细胞的冻存实验的基本原理是利用液氮的低温特性以及二甲亚砜（DMSO）或甘油这两种无毒性的物质进入细胞中，使细胞内冰点下降，并可提高细胞膜对水的通透性，配合以缓慢冷冻的方法，可使细胞内的水分逐步地渗透出胞外。

操作方法

细胞的冻存实验（细胞的冻存实验）

原理

细胞的冻存实验的基本原理是利用液氮的低温特性以及二甲亚砜（DMSO）或甘油这两种无毒性的物质进入细胞中，使细胞内冰点下降，并可提高细胞膜对水的通透性，配合以缓慢冷冻的方法，可使细胞内的水分逐步地渗透出胞外。

材料与仪器

器材：
① 培养的贴壁细胞（70％～80％ 融合）
② 离心管
③ 吸管
④ 冻存管
⑤ 离心管
⑥ 液氮罐
⑦ 超净工作台
试剂:
① 0.5% 胰蛋白酶
② 冻存液
③ 液氮

步骤

细胞的冻存实验基本过程可分为以下几步： A. 依照传代的方法用 0.25% 胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。 B. 收集消化细胞于离心管中，800～1000 r/min 离心 5 min。 C. 弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为 5 x 10⁶～1 x 10⁷ 个/ml。 D. 每个冻存管分装细胞悬液 1 ml，旋紧冻存管的盖，并用蜡膜封严。 E. 在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。 F. 将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4 ℃，1 h→- 20 ℃，2 h→- 85 ℃，2 h→液氮。

注意事项

1. 对数期的细胞增殖能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。

2. 为了保证冻存的质量及复苏后细胞的存活率，冻存时应掌握好消化时间，消化过度将对细胞造成损伤，复苏时细胞难于存活。此外，复苏后接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在 5x106～1 x 107个/ml，这样才能保证复苏成功。

3. 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢；对一些冷冻耐受性较差的细胞，如胚胎细胞，冻存时应特别小心，可在冻存管外包裹一层棉花，以避免冻存过程中细胞受到损伤。

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